[发明专利]骨肉瘤诊断试剂盒及CPE基因在其制备中的用途

说明书

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及一种骨肉瘤诊断试剂盒及CPE基因在制备骨肉瘤诊断试剂盒中的应用。

背景技术

在转录组研究中应用最早及最广泛的是基因芯片技术，首先从待检测样品中提取RNA，并利用荧光标记的核苷酸将其反转录成cDNA，经过标记的核苷酸序列可与基因芯片特定位点上的探针杂交，经检测杂交信号而获取细胞基因表达信息。基因芯片技术已成为一项非常稳定可信的实验技术，目前公布的大量转录组数据主要是利用基因芯片技术产生的。

骨肉瘤是来源于间叶组织的恶性肿瘤，其主要致病特征为体内增殖的肿瘤细胞直接形成未成熟骨或骨样组织，是一种人类骨骼系统最常见的原发性恶性肿瘤。目前，国内筛选该疾病的相关基因主要采用基因芯片技术构建表达谱的方法。随着生物技术的发展，实验研究产生了大量的基因芯片数据，并通过基因表达芯片筛选出了影响骨肉瘤发生发展的基因及信号通路，已鉴别出大量差异表达的基因。但是不同的实验平台及样本的差异导致各个基因芯片的分析结果存在很多不一致性。

Meta分析可对同一个问题所发表相关研究报告的结果进行收集、统计上的整合，以期获得更准确或更多的结果。这个分析能产生很多显著的差异表达基因，能避免单个研究带来的不正确性。Meta分析是在多个芯片实验研究中识别差异表达基因的强有力工具。此外，用Meta分析能识别出单个研究不能识别的差异基因，并且能有效地降低单个芯片数据的假阳性。

本发明通过对已发表的骨肉瘤转录组表达数据进行Meta分析，筛选出影响骨肉瘤发生发展的关键基因，并使用荧光实时定量PCR(QPCR)检测验证临床样本中的表达，本发明通过生物信息学手段发掘这些基因在骨肉瘤中的作用，从而对骨肉瘤的发病机理进行探究，为其诊断和治疗提供一定的研究基础。

发明内容

本发明通过对已发表的骨肉瘤转录组表达数据进行Meta分析和QPCR验证，发现CPE基因在骨肉瘤组织中的表达与在正常组织中的表达存在差异。与正常组织相比，CPE基因在骨肉瘤组织中表达上调，通过检测CPE基因转录水平的表达情况，可以判断受试者是否患有骨肉瘤。

本发明的目的在于提供CPE基因在制备骨肉瘤诊断试剂盒中的用途。所述诊断试剂盒包含SYBR Green聚合酶链式反应体系、用于扩增CPE基因和管家基因的引物对。SYBR Green聚合酶链式反应体系包含PCR缓冲液、dNTPs、SYBR Green荧光染料。

上述技术方案中，PCR缓冲液为本领域技术人员公知的现有技术，优选地，PCR缓冲液包含：25mM KCl，2.5mM MgCl₂，200mM(NH₄)₂SO₄。

引物对是本领域技术人员可以根据引物设计的常规设计原则设计。优选的实施方案中，扩增CPE基因的正向引物序列为5'-AGCATCCAGTGATAACATC-3’，反向引物序列为5’-CTAGGCGGTCATTCTTAC-3’；管家基因优选GAPDH，扩增该基因的正向引物序列为5’-TTTAACTCTGGTAAAGTGGATAT-3’，反向引物序列为5’-GGTGGAATCATATTGGAACA-3’。

在本发明的一个具体的实施方案中，本发明的诊断试剂盒还包含M-MLV逆转录体系，该逆转录体系包含：T重复寡核苷酸Oligo(dT)、逆转录反应液、M-MLV逆转录酶、RNA酶抑制剂、dNTPs。

优选逆转录反应液包含：250mM PH8.3的Tris-HCL，375mM的KCL，15mM的MgCl₂，50mM的DTT。

RNA酶抑制剂可选用本领域常用的RNA酶抑制剂，优选为大肠杆菌表达的非竞争性抑制RNA酶的重组蛋白酶。

在本发明的一个具体的实施方案中，本发明的诊断试剂盒还包含RNA提取试剂，RNA酶提取试剂包含Trizol、氯仿、异丙醇、75％乙醇。

本发明的诊断试剂盒保存于-20℃，尽量减少反复冻融。

本发明的又一个目的在于提供一种诊断骨肉瘤的试剂盒。所述诊断试剂盒包含SYBR Green聚合酶链式反应体系、用于扩增CPE基因和管家基因的引物对。所述SYBR Green聚合酶链式反应体系包含PCR缓冲液、dNTPs、SYBR Green荧光染料。