[发明专利]一种蛋白质亲和层析洗脱方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地说涉及一种蛋白质的亲和层析洗脱方法。

背景技术

治疗性蛋白，尤其是单克隆抗体的出现给免疫预防和治疗带来突破性的进展，抗体以其具有理化性状高度均一、生物活性单一、便于工艺放大及质量保证，以及能与抗原良好的特异性结合，而具有良好的靶向作用等特点，备受亲睐。

亲和层析(affinitychromatographygraphy，AC)是抗体纯化的一种重要的方法，具有很高的选择性、分离性能以及较高的载量，它通常只需要一步处理即可将某种待分离的蛋白质从复杂的蛋白质混合物中分离出来，是分离纯化蛋白质的有力工具。亲和层析技术是基于某种蛋白质所具有的生物学特异性，即蛋白质可与另一种称作配体的大分子能发生特异的可逆结合。所谓的配体是指能被蛋白质所识别并与之结合的原子、原子团或分子。亲和层析的基本原理是：把待纯化的某种蛋白质的特异配体，通过化学反应共价连接到载体表面的功能基上构成配基。载体的性能方面允许蛋白质自由通过，当含有目的蛋白的混合样品加到该配基上时，目的蛋白即和其特异性配体结合而吸附在配体载体的表面，而其他杂质则被洗出。被特异地结合在配基上的目的蛋白质可通过改变缓冲液的条件使之解吸附，并进一步收集。(沈同,王镜岩.生物化学第二版[M]1990,223)

StaphyrococcalProtein(以下简称蛋白A)，来源于微生物的FC受体，其对抗体的FC区域具有极高的结合能力，并且是可逆的。蛋白A亲和层析常常是抗体药物纯化的第一步，它是将蛋白A作为配基固定于载体上，能特异性吸附抗体，而不吸附其他杂质，通过此特点来纯化抗体。

亲和层析虽然能达到很好地捕获抗体的目的，但是在吸附抗体的同时，其它可以和蛋白A结合的杂质同样也和抗体一样结合在蛋白A上，最终和抗体一起解离下来，从而带入纯化的抗体中，从而影响抗体的纯度。随着抗体纯化规模的发展，三步纯化，甚至两步纯化的要求越来越迫切。这就迫切需要一种新的亲和层析洗脱方法，以便进一步提高抗体的纯度。

为了更好对蛋白质进行纯化，某些抗体在纯化过程中，需在极低pH条件下洗脱，例如pH3.0-5.0，但这很容易改变抗体的高级结构，进而导致频繁发生抗体互相结合和聚集。酸性条件下抗体的高级结构的改变，已被Biochemistry等人的研究所证实(Renner,H.Lilie,etal.,Alternativelyfoldedstatesofanimmunoglobulin,Biochemistry30(1991)6922–6929.、或者A.W.P.Vermeer,W.Norde,Thethermalstabilityofimmunoglob-ulin:unfoldingandaggregationofamulti-domainprotein,Bio-phys.J.78(2000)394–404.、或者K.WelXe,R.Misselwitz,G.Hausdorf,W.Hohne,H.WelXe,Con-formation,pH-inducedconformationalchange,andthermalunfoldingofanti-p24(HIV-1)monoclonalantibodyCB4-1anditsFabandFcfragments,Biochim.Biophys.Acta1431(1999)120–131.)。而抗体的大量聚集情况发生，会使洗脱抗体时很容易产生浑浊或沉淀。而且抗体经过低pH后，即使马上调节回中性，高级结构的变化也不会恢复，即该聚集的发生是一个不可逆的过程。为解决这些问题，弓冈良辅等发明了一种通过调整pH至4.0～5.0同时使用含有精氨酸和/或精氨酸衍生物的微酸性缓冲液来防止抗体变性的精制抗体方法，洗脱抗体主峰表现出同pH3.5的柠檬酸缓冲液相同的回收率【专利文献：CN200510004669.6】。

因此，一种能有效去除聚集体和小分子、降低宿主细胞蛋白(Hostcellprotein,HCP)残留、同时避免抗体亲和洗脱浑浊或沉淀现象产生的一种抗体精制方法仍是目前所迫切需要的。

发明内容

本申请的发明人经过大量研究，发明了一种蛋白质亲和层析洗脱方法，其特征在于，在蛋白A亲和层析蛋白质中，使用低pH值(优选pH3.5-4.0)柠檬酸+精氨酸缓冲液，洗脱蛋白质主峰，并回收。从而提高亲和纯化的蛋白质纯度并解决某些蛋白质低pH洗脱出现浑浊和沉淀现象。具体地：