[发明专利]一种从樟芝菌固态发酵粉中提纯安卓奎诺尔的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种从樟芝菌固态发酵粉中提纯安卓奎诺尔的方法，属于生物制药领域。

背景技术

安卓奎诺尔，英文名称为(Antroquinonol)，是一种潜在的抗癌药物。安卓奎诺尔是发现于牛樟芝子实体中的化合物，分子式C₂₄H₃₈O₄，分子量为390g/mol。纯化的安卓奎诺尔为淡黄色油状，具有低水溶性之特性(<0.1mg/ml)，具有高度稳定性，可于室温(25℃)或低温环境(4℃)维持稳定性至少长达24个月。

生理活性物质安卓奎诺尔是2007年Lee等人利用正己烷从樟芝子实体中萃取并鉴定一种新化合物，属于泛醌类的衍生物。2010年Chiang等人研究表明安卓奎诺尔可以通过活化AMPK来抑制胞内蛋白质的合成途径，进而抑制细胞周期，从而产生抗癌效果。2012年Tsai等研究发现安卓奎诺尔具有抗氧化应激和抗炎等活性。由于安卓奎诺尔具有显著的抗癌活性，并且，它对于癌细胞与正常细胞具有选择性，目前已进入FDA二期临床实验，是具有优良前景的抗癌化合物。

高纯度的安卓奎诺尔不仅在保健品、医药领域有着广阔的应用潜力，而且对于其生理功能方面的深入研究具有很重要的价值。目前，安卓奎诺尔的提纯仅以牛樟芝的菌丝体为原料，采用柱层析结合半制备色谱的方法进行提纯，但安卓奎诺尔的纯度仍不高，不能达到做参照标准品的要求。本发明以樟芝固态发酵粉为原料，制备获得了高纯度的安卓奎诺尔。

发明内容

本发明的目的在于提供一种从樟芝固态发酵粉中提纯安卓奎诺尔的方法，以樟芝菌固态发酵粉末为原料，通过萃取、浓缩除杂、一次柱层析、半制备色谱、二次柱层析、浓缩等步骤，得到高纯度的含安卓奎诺尔的产品。

所述方法主要包括以下步骤：

(1)萃取：将樟芝固态发酵粉末，以无水乙醇反复浸提多次，然后合并滤液得到安卓奎诺尔粗提浓缩液；

(2)浓缩除杂：除去步骤(1)粗提浓缩液中的乙醇，以体积分数50％-90％的乙酸乙酯水溶液反复萃取3次；收集合并乙酸乙酯相，除去乙酸乙酯，得到浓缩液1；

(3)一次柱层析：柱层析填料为60-80目或100-200目的硅胶，或非极性或中极性的大孔树脂，采用梯度洗脱，以乙醇水溶液或选自酯类、醇类、烷类或卤烷所组成的族群中的两种物质混合作为洗脱剂进行梯度洗脱，洗脱后的流分分段收集，合并含安卓奎诺尔的流分，旋转蒸发得到浓缩液2；

(4)半制备色谱：将浓缩液2以半制备色谱分离纯化，流动相为体积分数80-100％的乙腈水溶液，流速：2mL/min，采用普通C18的制备色谱柱，柱温20-40℃；UV检测器，检测波长为254nm；根据出峰时间收集物质，收集液浓缩后得到浓缩液3；

(5)二次柱层析：柱层析填料为200-300目的硅胶，以选自酯类、醇类、烷类或卤烷所组成的族群的两种物质混合作为洗脱剂进行梯度洗脱，洗脱后的流分分段收集；

(6)浓缩：对收集的含安卓奎诺尔的样品进行常压浓缩或真空浓缩。

所述方法优选以下步骤：

(1)萃取：将安卓奎诺尔含量范围在300mg/kg～1000mg/kg的樟芝固态发酵粉末，按照料液比1g:5mL-1g:15mL的比例加入无水乙醇，20-40℃下，浸提、过滤，反复3次，然后合并滤液得到安卓奎诺尔粗提浓缩液。

(2)浓缩除杂：在40-50℃下真空旋转蒸发除去乙醇得到安卓奎诺尔粗提浸膏，粗提浸膏按1g:5mL-1g:20mL的比例加入50％-90％(v/v)乙酸乙酯水溶液进行萃取，静置分层，萃取3次。收集合并乙酸乙酯相，在40-50℃下真空旋转蒸发除去乙酸乙酯，得到浓缩液1。

(3)一次柱层析：柱层析填料为60-80目或100-200目的硅胶，或非极性或中极性的大孔树脂，采用梯度洗脱，以乙醇水溶液或选自酯类、醇类、烷类或卤烷所组成的族群中的两种物质以体积比0-100％混合作为洗脱剂进行梯度洗脱，洗脱后的流分分段收集，合并含安卓奎诺尔的流分，旋转蒸发得到浓缩液2。

(4)半制备色谱：将浓缩液2以半制备色谱分离纯化，流动相为体积分数80-100％的乙腈水溶液，流速：2mL/min，采用普通C18的制备色谱柱，柱温20-40℃；UV检测器：检测波长为254nm；根据出峰时间收集物质，收集液浓缩后得到浓缩液3。

(5)二次柱层析：以选自酯类、醇类、烷类或卤烷所组成的族群的两种物质混合作为洗脱剂，进行梯度洗脱，洗脱后的流分分段收集。