[发明专利]一种在线快速检测样品总抗氧化性的方法

说明书

技术领域

本发明属于检测分析技术领域，涉及一种利用高效液相色谱和自由基检测系统在线快速检测样品总抗氧化性的方法。

背景技术

自20世纪80年代，出于对人工合成的抗氧化剂的安全性考虑，人们越来越倾向于开发使用天然的抗氧化剂。从草药、水果和蔬菜中分离植物成分用作食品、化妆品和药品中的防腐剂成为研究热点。例如水果、蔬菜，牛奶，脂肪、蛋黄和海鱼都是很好的抗氧化物质来源。目前已经报道，具有潜在的抗氧化性的天然抗氧化物质有：茶多酚、大豆异黄酮、枸杞多糖、天然虾青素、黄体素、硫辛酸、α-亚麻酸(ALA)、番茄红、维生素E、维生素C、β-胡萝卜素、辅酶Q10、超氧化物歧化酶(SOD)、大豆肽、肌肽和谷胱甘肽、金属硫蛋白、硒，大蒜中的硫化物，等。

目前，评价生物活性物质抗氧化能力的研究已经在全世界得到广泛关注。随着高效液相色谱，质谱技术及以核磁共振等现代科学技术的出现及发展，抗氧化活性研究也出现了在线抗氧化检测系统。大部分报道是指与HPLC联用的抗氧化在线检测技术。例如在线HPLC-RSD (High Performance Liquid Chromatography-Radical Scavenger Detection)或者HPLC-RSD-NMR/MS分析抗氧化活性系统。HPLC在线(On-line)抗氧化检测系统是指通过HPLC系统与柱后自由基衍生系统连接起来，实现HPLC系统对样品中目的化合物质的洗脱及分离，这些化合物洗脱出来，随流动相进入柱后自由基衍生系统，同时检测器检测化合物清除自由基的能力。通常以自由基溶液色谱倒峰图体现。倒峰图面积越大，代表自由及被清除的越多，代表样品的抗氧化性强。同时使用标准抗氧化物质浓度与负峰面积建立标准曲线和标准物质抗氧化当量换算，从而实现分析样品的抗氧化活性。相对与在线检测方法，文中提到的传统抗氧化研究方法称为非在(Off-line)法。HPLC联用的在线系统克服了传统非在线抗氧化剂筛选方法纯化步骤繁琐，化合物提取、纯化和抗氧化性测定多步操作，费时和费力的问题。HPLC联用的在线系统可以实现高效、快速对植物或食品中的天然抗氧化物质进行分离、定性、定量的研究。高效液相色谱技术可以减少样品前处理的样品纯化步骤，直接检测；生物化学检测柱后衍生系统的联用，有利于分析色谱系统分离出化合物的生物活性。王小淞等选取DPPH 自由基为检测

用自由基，检测了黄芩根提取物中的抗氧化活性成分。张雷等、傅茂润等也以相似的的方法检测了茶叶、紫薯中的抗氧化物质。DPPH 自由基稳定，系统组成与使用ABTS 自由基类似，但灵敏度不及ABTS 自由基。裴世春等、高翔等、耿雪飞等利用ABTS 自由基联用HPLC 检测植物材料中抗氧化物质。西北农林科技大学申请了利用ABTS 自由基检测混合物中抗氧化活性物质的发明专利( 申请号201110330342.6)。

物质总抗氧化能力(Total Antioxidant Capacity)是物质清除不同的自由基或者是物质的不同活性成分、清除不同的自由基的有效和。由于样品总抗氧化活性的好坏，是筛选天然抗氧化资源的依据，也是进行抗氧化活性物质分离和鉴定的理论依据。评价物质的总抗氧化活性是很有必要的。目前国内外常用的测定总抗氧化活性的方法有DPPH法，ABTS法，ORAC法，FRAP法。但是这些方法对于大规模的分析植物样品存在着操作步骤繁琐，耗时耗力的缺点。大规模分析样品的总抗氧化性有望依赖目前已经报道HPLC在线检测系统。ORAC法(由于其实验过程中荧光物质对pH敏感)和FRAP法(由于实验操作繁琐)，都太不利于在线抗氧化检测。自由基捕获法，其自由基化学性质稳定，反应迅速适用于HPLC在线抗氧化检测。目前已经实现了HPLC-DPPH法和HPLC-ABTS 法在线检测植物样品抗氧化性活性。但是目前报道的HPLC-DPPH/ABTS法的特点是在线分析单个化合物的抗氧化性，对与总混合物的抗氧化活性并不能直接且快速的测定。关于HPLC-在线快速检测样品的总抗氧化活性研究未见报道。所以，急需要建立一种快速的分析总抗氧化性的测定方法，并可以被科研或工业所利用。

发明内容

本发明的目的是针对现有的分析物质总抗氧化性的测定方法中存在的技术缺陷，提供一种能够快速，准确地测定样品的总抗氧化性的方法，本发明方法测定过程中色谱图峰型完整、美观，无拖尾现象；测定结果准确、快速、选择性强而且灵敏度高。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：