[发明专利]一种球根鸢尾病毒检测引物及方法

说明书

【技术领域】

本发明涉及生物学领域的一种植物病毒检测方法，具体涉及一种球根鸢尾病毒检测引物及方法。

【背景技术】

鸢尾轻花叶病毒(Iris mild mosaic virus，IMMV)、水仙潜隐病毒(Narcissus latent virus，NLV)和菜豆黄花叶病毒(Bean yellow mosaic virus，BYMV)是危害球根鸢尾的三种主要病毒。

在田间这三种病毒常常复合侵染，造成球根鸢尾花色斑驳、叶片产生花叶退绿、切花的数量和质量明显下降，从而严重影响球根鸢尾的品质。当种球连续种植几年后，病毒积累到一定程度，会造成种球的退化，失去再利用的价值，这几种病毒的复合侵染已经成为球根鸢尾大规模生产的主要限制因素。目前，球根鸢尾病毒尚无特别有效的化学防治方法，因此，对球根鸢尾进行病毒鉴定，结合茎尖组培脱毒使种球复壮，显得尤为重要，但在种球复壮过程中，经常需要对其进行病毒检测。

目前，植物病毒检测大多采用基于抗血清的酶联免疫吸附技术(即ELISA方法)，但抗血清不仅价格较高、一种抗血清只能检测一种病毒、检测程序繁琐，而且还存在一定程度的假阳性反应、检测灵敏性相对较低等问题。近年来，为了提高病毒检测效率，基于PCR技术的病毒检测技术正在迅速发展，但单重PCR检测技术，一个反应只能检测一种病毒，若应用于田间多种病毒复合侵染的球根鸢尾病毒的检测，则存在着耗时、耗力、费用高的问题。

【发明内容】

本发明所要解决的技术问题在于提供一种球根鸢尾病毒检测引物及方法。

本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题的：一种球根鸢尾病毒检测引物，其具体包括如下三个引物对：

鸢尾轻花叶病毒引物对：正向引物5'-GAAGGTAAAGCACCATACAT-3'，反向引物5'-CGTGCTAGTGACATATCGGTAA-3'；

水仙潜隐病毒引物对：正向引物5'-AATTGGTGCATTTGGTGC-3'，反向引物5'-TCAAAAGCGTAGGGGATCAT-3'；

菜豆黄花叶病毒引物对：正向引物5'-AGACACACAGCAGGAGATGT-3'，反向引物5'-GCTTACCCTGTCAGAGTAGA-3'。

进一步地，所述鸢尾轻花叶病毒引物对对鸢尾轻花叶病毒PCR扩增出770bp的产物；所述水仙潜隐病毒引物对对水仙潜隐病毒PCR扩增出266bp的产物；所述菜豆黄花叶病毒引物对对菜豆黄花叶病毒PCR扩增出186bp的产物。

进一步地，利用上述三个引物对对球根鸢尾病毒进行检测，其检测方法如下：根据鸢尾轻花叶病毒、水仙潜隐病毒和菜豆黄花叶病毒三种病毒的外壳蛋白基因的核苷酸序列分别设计合成出如权利要求1中所述鸢尾轻花叶病毒引物对、水仙潜隐病毒引物对及菜豆黄花叶病毒引物对；然后分别利用鸢尾轻花叶病毒引物对对球根鸢尾叶片中的鸢尾轻花叶病毒、水仙潜隐病毒引物对对球根鸢尾叶片中的水仙潜隐病毒、菜豆黄花叶病毒引物对对球根鸢尾叶片中的菜豆黄花叶病毒进行mRT-PCR反应，最后将反应产物进行1％琼脂糖凝胶电泳分析和克隆测序比对。

进一步地，所述mRT-PCR反应的反应体系和反应程序如下：

反应体系：反应体系的总体积为50μL，含有0.3μL5U/μL的Taq酶、5μL的10×Taq酶buffer、4μL2.5mmol/L的dNTPs、1μL模板、0.12-0.32μmol/L的鸢尾轻花叶病毒正向引物、0.12-0.32μmol/L的鸢尾轻花叶病毒反向引物、0.08-0.24μmol/L的水仙潜隐病毒正向引物、0.08-0.24μmol/L的水仙潜隐病毒反向引物、0.04-0.24μmol/L的菜豆黄花叶病毒正向引物、0.04-0.24μmol/L的菜豆黄花叶病毒反向引物，其余成分为灭菌双蒸水；其中，每所述引物对中的正向引物和反向引物的浓度均相等，所述鸢尾轻花叶病毒正向引物、鸢尾轻花叶病毒反向引物、水仙潜隐病毒正向引物、水仙潜隐病毒反向引物、菜豆黄花叶病毒正向引物、菜豆黄花叶病毒反向引物的浓度均是以反应体系的总体积50μL为基准；

反应程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，48-58℃退火30s，72℃延伸1min，循环35次；72℃延伸10min；4℃终止反应。

本发明的有益效果在于：