[发明专利]一株高产尼莫克汀的产色链霉菌及其筛选方法

权利要求书

1.一株高产尼莫克汀的产色链霉菌，其特征在于：分类名称为产色链霉菌(Streptomyces cyanneorisens)DC18-01，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会，保藏编号为CGMCC No.6217，保藏日期为2012年6月14日。

2.根据权利要求1所述的一株高产尼莫克汀的产色链霉菌的筛选方法，其特征在于，包括以下操作步骤：

a、出发菌株斜面培养：以砂土管保藏的产色链霉菌为出发菌株，使用无菌接种针蘸取少量砂土孢子，划线接种于试管斜面培养基中，于26-30℃、30％-60％湿度条件下培养96-144h，得到斜面菌种；

b、制备孢子液：用15-20mL无菌水将步骤a制备的斜面菌种洗下制成孢子液；

c、紫外线诱变筛选：取5mL步骤b制备的孢子液于灭菌的培养皿中，于波长254nm、功率30W的紫外灯下30cm处垂直照射120s，照射后立即用无菌锡纸包住，避光静置15min，使用无菌水将紫外线照射过的孢子液稀释至孢子液10^-2-10^-8，取稀释后的孢子液0.1-0.3mL涂布于含有乙酸钠浓度为0.1-0.5mg/L的固体培养基中，26-30℃、30％-60％湿度条件下培养96-144h，得到成熟的单菌落；

d、斜面培养：将步骤c培养成熟的单菌落划线转接至斜面培养基中，于26-30℃、30％-60％湿度条件下培养96-144h，得到斜面孢子；

e、种瓶培养：挖取2-5cm²步骤d制备的斜面孢子接种于种瓶培养基中，于26-30℃，220-240rpm震荡培养24-30h得到成熟种液；

f、对照菌液的制备：以砂土管保藏的的产色链霉菌为出发菌株，依次经过步骤a、步骤b、步骤d、步骤e得到对照菌液；

g、发酵摇瓶筛选：以体积比2％-8％的接种量将步骤e制备的成熟种液转接至含有的乙酸钠浓度为0.05-0.2mg/L的发酵培养基中，于26-30℃、220-240rpm震荡培养240-288h，检测效价，以体积比2％-8％的接种量将步骤f制备的对照菌液接种至不含乙酸钠的发酵培养基中，于26-30℃、220-240rpm震荡培养240-288h，检测效价，选取检测效价高于对照菌液的斜面，向其中加入1mL无菌水，用接种针刮下斜面孢子，制成孢子悬液，吸取0.2mL孢子悬液至空白砂土管中，在-750-760mmHg柱条件下干燥4-6h后于2-8℃冰箱中砂土保藏，得到保藏菌株；

h、菌株复试：取步骤g筛选的砂土保藏的砂土孢子划线接种于斜面培养基中，于26-30℃、30％-60％湿度条件下培养96-144h；挖取2-5cm²斜面孢子接种于种瓶培养基中，于26-30℃、220-240rpm震荡培养24-30h，得到复试菌株成熟种液；取出发菌株的砂土孢子作相同处理，得到出发菌株成熟种液，以体积比2％-8％接种量将复试菌株成熟种液转接至含有的乙酸钠浓度为0.05-0.2mg/L的发酵培养基中，以体积比2％-8％接种量将出发菌株成熟种液转接至不含有乙酸钠的发酵培养基中，于26-30℃、220-240rpm震荡培养240-288h，检测效价，并进行效价对比；

i、稳定性考察：取步骤g保藏的砂土孢子划线接种于斜面培养基中，于26-30℃、30％-60％湿度条件下培养96-144h，得到成熟斜面孢子；将成熟斜面孢子再划线转接于斜面培养基中，连续转接三次后挖取2-5cm²斜面孢子接种于种瓶培养基中，于26-30℃、220-240rpm震荡培养24-30h得到成熟种液；以体积比2％-8％接种量将成熟种液转接至含有的乙酸钠浓度为0.05-0.2mg/L的发酵培养基中，于26-30℃、220-240rpm震荡培养240-288h，检测效价，判断斜面传三代后相较于一代斜面接入种瓶再接入发酵摇瓶后，摇瓶效价的相对标准偏差。

3.根据权利要求2所述的一株高产尼莫克汀的产色链霉菌的筛选方法，其特征在于：操作中所用斜面培养基成分及用量(g/100mL)为：葡萄糖0.3-0.5、麦芽糖0.1-0.15、酵母膏或酵母粉0.3-0.5、淀粉0.4-0.6、黄豆饼粉0.4-0.6、糊精0.4-0.6、磷酸氢二钾0.01-0.03、琼脂1-2。