[发明专利]一种流感血凝素糖蛋白多聚物纳米颗粒的制备方法

权利要求书

1.一种制备流感病毒血凝素糖蛋白聚合物纳米颗粒的方法，包括如下步骤：使N端上游含有信号肽序列、并包含C-端穿膜区序列的流感病毒的血凝素HA基因在酵母中表达；将所述酵母进行细胞破碎，加入去污剂，获得含流感病毒血凝素糖蛋白的溶液；将所述溶液进行纯化，制备得到具有血凝活性的流感病毒血凝素糖蛋白聚合物纳米颗粒。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述使N端上游含有信号肽序列、并包含C-端穿膜区序列的流感病毒的血凝素HA基因在酵母中表达的方法为将N端上游含有信号肽序列、并包含C-端穿膜区序列的流感病毒的血凝素HA基因的重组表达载体转化酵母，培养得到转化的酵母，再诱导使基因表达；

所述酵母为毕赤酵母、汉逊酵母或乳酸克鲁维酵母。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述流感病毒的血凝素HA为H1、H3、H5或H7血清型流感病毒的HA。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述H1、H3、H5或H7血清型流感病毒的HA分别为H1N1、H3N2、H5N1或H7N9流感病毒的HA。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述重组表达载体是将所述N端上游含有信号肽序列、并包含C-端穿膜区序列的流感病毒的血凝素HA基因插入含有AOX启动子的载体得到，具体是将所述N端上游含有信号肽序列、并包含C-端穿膜区序列的流感病毒的血凝素HA基因插入pPICZα的NotI和NspV酶切位点间，并用BglII线性化得到；

所述酵母为毕赤酵母；

所述流感病毒为H7N9禽流感病毒，所述N端上游含有信号肽序列、并包含C-端穿膜区序列的流感病毒的血凝素HA基因如SEQ ID No.4所示；

或，

所述流感病毒为甲型H1N1流感病毒，所述N端上游含有信号肽序列、并包含C-端穿膜区序列的流感病毒的血凝素HA基因如SEQ ID No.14所示；

或，

所述流感病毒为甲型H3N2流感病毒，所述N端上游含有信号肽序列、并包含C-端穿膜区序列的流感病毒的血凝素HA基因如SEQ ID No.21所示。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述重组表达载体是将所述N端上游含有信号肽序列、并包含C-端穿膜区序列的流感病毒的血凝素HA基因插入含有MOX启动子的载体得到，具体是将所述N端上游含有信号肽序列、并包含C-端穿膜区序列的流感病毒的血凝素HA基因插入pPICZα的NotI和BstB I酶切位点间，得到中间载体1；再将中间载体1的AOX启动子替换为汉逊酵母的醇氧化酶启动子MOX，再用BglII线性化得到；

所述酵母为汉逊酵母；所述汉逊酵母为多型汉逊酵母；

所述MOX启动子是以多型汉逊酵母的基因组DNA为模板，以SEQ ID No.9和SEQ IDNo.10所示的DNA分子为引物进行PCR扩增得到MOX启动子；

所述将中间载体1的AOX启动子替换为汉逊酵母的醇氧化酶启动子MOX的方法为将所述PCR扩增得到的MOX启动子进行BglII酶切，并进行磷酸化，获得5’端为BglII酶切粘性末端，3’端磷酸化的MOX启动子；将中间载体1用NspV单酶切后用Klenow fragment大片段酶和dNTP补平，得到片段，回收片段后，再用BglII酶切，切除AOX启动子，得到切除AOX启动子的中间载体1；将5’端为BglII酶切粘性末端，3’端磷酸化的MOX启动子与切除AOX启动子的中间载体1连接；

所述流感病毒为H5N1禽流感病毒，所述N端上游含有信号肽序列、并包含C-端穿膜区序列的流感病毒的血凝素HA基因具体如SEQ ID No.8所示。