[发明专利]一种铬富集植物李氏禾RAPD反应体系的建立方法

说明书

技术领域

本发明属于植物修复技术领域，涉及一种铬富集植物李氏禾RAPD反应体系的建立方法。

背景技术

植物修复技术具有技术和经济上的双重优势，而李氏禾在水土保持和重金属污染修复等方面具有重要意义,其在特殊生境下的适应性也日益受到学者关注。而目前关于李氏禾的研究还是多集中于生态和生理机制方面，在分子水平上的研究还很少。因此，采用分子标记等分子生物学技术从分子水平上进一步揭示李氏禾富集重金属的分子机制具有重要意义。RAPD与其它分子标记技术相比，因其具有操作简便快捷、DNA用量少、灵敏度高、引物具有通用性且无需预先了解物种基因组信息等优点而被广泛应用于遗传图谱构建、基因定位和遗传多样性的检测。但是RAPD反应具有比较容易受到实验条件的影响，如果设备条件及实验操作达不到要求，实验结果的重复性与稳定性就较难得到保证。

发明内容

为了克服现有技术中存在的缺陷，本发明提出了一种铬富集植物李氏禾RAPD反应体系的建立方法，该方法通过用CTAB法提取李氏禾的总DNA，针对模板、引物、dNTP、Taq酶四个方面的用量进行探索，从而建立李氏禾的RAPD最适反应体系，为进行RAPD分析研究重金属铬污染下李氏禾居群的遗传多样性奠定基础，进而为进一步从分子水平上研究李氏禾耐淹耐干旱能力和重金属富集能力与其在遗传特性上的关系提供相关的分子生物学方面的研究数据。其技术方案如下：

一种铬富集植物李氏禾RAPD反应体系的建立方法，包括以下步骤：

(1)李氏禾基因组总DNA的提取

①取硅胶干燥后的李氏禾叶片50mg放入已灭菌1.8mL离心管，加入适量石英砂和玻璃珠，珠磨器研磨1min至叶片成均匀粉末；

②加入65℃预热的0.8mL2×CTAB和20μL巯基乙醇，混合均匀，65℃水浴3小时，每间隔10分钟摇匀一下，然后10000rpm，离心10min；

③量取上清，加入酚、氯仿和异戊醇，酚/氯仿/异戊醇的体积比为25:24:1，颠倒混匀，12000rpm，离心10min；

④量取上清，加入氯仿和异戊醇，氯仿/异戊醇体积比为24:1，颠倒混匀，然后12000rpm离心10min；

⑤小心量取上清，加入1/10体积的NaAc，轻轻翻转混匀；

⑥加入的异丙醇，轻轻上下颠倒离心管8～10次，冰浴20min，使DNA沉淀充分；

⑦10000rpm离心5～10min，弃去上清，用70％乙醇洗涤沉淀1次；

⑧再用100％乙醇洗涤沉淀1次，倒置离心管至管内完全干燥，加20μL无菌水溶解DNA。

⑨取5μLDNA溶液进行电泳检测，其余于-20℃放置保存；

(2)李氏禾RAPD反应随机引物的初步筛选：确定使用引物S55作为李氏禾RAPD反应体系优化的引物；

(3)所述李氏禾RAPD反应体系中模板DNA用量为0.5μL；

(4)所述李氏禾RAPD反应体系中包含0.5μLdNTP，对应于dNTP的浓度为200μmol/L；

(5)所述李氏禾RAPD反应体系中Taq酶的最适用量为2.0U。

进一步优选，步骤(2)中引物的用量确定为0.3μL，对应于引物的浓度为120μmol/L。本发明的有益效果为：

本发明建立的李氏禾优化反应体系可以应用于李氏禾RAPD分析，检测其多态性位点和是否存在重金属敏感片段等，为进一步了解李氏禾种群的遗传分化和遗传多样性，研究其重金属超富集机理提供参考数据。另外，从近期来看，植物修复技术的研究集中的一个方面是分子生物学和基因工程技术的应用，即将自然界中超积累植物的耐重金属、超累积基因移植到生物量大生长速率快的植物中去，以克服天然超累积植物的缺陷，提高植物修复效率使其实用化。因此，本研究也期望能为从分子水平研究李氏禾的耐重金属、超累积基因提供了一些数据或参考。

附图说明

图1为李氏禾总DNA电泳图谱，注：泳道1-7为李氏禾样品的基因组总DNA；泳道M为DNAMarker(λDNA/EcoRI+HindIII)；

图2为不同模板DNA用量的扩增结果，泳道1-6分别代表0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6μL的DNA用量；

图3为不同引物用量的扩增结果，泳道1-6分别代表0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6μL的DNA/引物用量；

图4为不同dNTP浓度的扩增结果，泳道1-6分别代表0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0μL的dNTP用量；