[发明专利]一种荧光探针及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及探针，更具体地，涉及一种荧光探针及其制备方法和应用。

背景技术

G-四链体(G-quadruplex)是一种特殊的DNA二级结构。人类基因组中很多富鸟嘌呤区域具有形成这一结构的能力，包括端粒末端鸟嘌呤重复序列，以及多种基因的启动子区域，如c-kit、c-myc、c-myb、bcl-2、PDGF、kRAS、VEGF、Rb和胰岛素基因等。G-四链体结构具有多态性，链的数量和取向、loop的连接方式以及鸟嘌呤的糖苷扭转角以及与羰基负电中心配位的金属离子等多方面决定了G-四链体的类型和构象，这些差异性也为蛋白和小分子化合物提供了多个识别位点。根据链的取向不同，G-四链体分为正平行，反平行与混合型三种构象。

G-四链体结构的形成对于体内的一系列生理过程都存在调控作用。研究证明，某些启动子区域的G-四链体结构会显著影响基因的转录和翻译水平，因此G-四链体结构被认为是起到分子开关的功能，其形成和拆散可能涉及到信号传导、细胞凋亡和细胞增殖等一系列体内重要的生理过程。所以，在体内或者体外试验中，能够特异性地检测出G-四链体结构的存在或者形成，对于研究G-四链体结构的相关生物学功能以及开发以G-四链体结构为靶点的抗癌药物等方面都具有非常重要的作用。

目前，在体内和体外检测G-四链体结构的研究都取得了一些进展。由于体内大大过量的双螺旋DNA的存在，以及复杂的细胞内环境，使得体内的检测相对于体外检测需要解决更多的难题，目前已有一些荧光分子可以实现体内G-四链体结构的检测。而目前能够对G-四链体构象进行鉴定的探针非常少，体外实验中检测G-四链体构象主要是通过仪器的手段，比如圆二色谱法、核磁共振等方法，这些方法对仪器和技术操作的要求都较高，而且价格较昂贵，基本上不能普及使用。

近年来，香豆素母体被广泛应用于生物、医药、香料、化妆品及荧光染料等领域。其苯并吡喃结构具有Stokes位移大、荧光量子产率高、以及光稳定性好等优点，使香豆素类结构成为荧光传感器分子设计中的优秀候选荧光团。而申请人实验室前期的工作中合成了一系列的三芳基咪唑类的化合物，其对正平行构象的G-四链体具有较好的选择性和结合能力。申请人将香豆素结构融合到三芳基咪唑结构当中，得到了新型的G-四链体探针，该探针选择性识别正平行构象的G-四链体。

发明内容

本发明提供一种荧光探针，其特征在于结构式为：

式中R₁选自F或N-甲基哌嗪基，R₂选自N-甲基哌嗪基。

一种如权利要求1所述的荧光探针的制备方法，其特征在于包括以下步骤：先用4-二乙胺基水杨醛与丙二酸二乙酯反应，得到化合物再将在POCl3的存在下与DMF反应，得到醛基香豆素中间体将溶于DMSO中，加入的N-甲基哌嗪和K2CO3，反应生成将与醛基香豆素中间体反应，得到最终探针化合物。

根据需求提供上述的荧光探针在检测G-四链体结构中的应用。

跟进一步的提供一种检测G-四链体结构的方法，包括如下步骤：

1)将待测DNA溶于PH值7.2-7.4的缓冲液，得到溶液A；将所述探针溶解，再用PH值7.2-7.4的缓冲液稀释，得到溶液B；

2)将溶液A和溶液B混合，使混合液中待测DNA与探针的摩尔比为1～10，混合后对混合液进行荧光光谱分析，或者在紫外灯下进行肉眼观察，判断待测DNA是否为正平行构象的G-四链体结构；判断方法如下：

(a)在紫外灯下进行肉眼观察时，与溶液B对比，若混合液在紫外灯下通过肉眼观察到荧光增强，则待测DNA为正平行构象的G-四链体结构；

(b)对混合液进行荧光光谱分析时，与溶液B相比，若混合液的荧光发射强度增强，则待测DNA为正平行构象的G-四链体结构。

判断方法(b)中，与溶液B相比，若混合液的荧光发射强度增强30～200倍，则待测DNA为正平行构象的G-四链体结构。

所述缓冲液为Tris-盐酸缓冲液。

所述探针用二甲基亚砜溶解。

溶液A和溶液B的混合反应时间为1分钟。