[发明专利]一种过表达苹果酸酶基因的重组载体及应用

说明书

技术领域：

本发明属于微藻基因工程领域，具体涉及一种过表达苹果酸酶基因的重组载体及应用。 

背景技术：

传统能源的不可再生性决定了其日益枯竭的趋势，且造成环境问题日益严重。能源危机和环境污染的日益严峻激起了人们的能源忧患意识及污染物零排放观念，加强了对废油脂及工业下脚料的回收处理及科学利用，推动清洁新型能源的开发利用。寻求一种安全可靠的、清洁的可再生能源已成为当今世界共同关注的焦点。生物能源是指利用生物可再生原料及太阳能生产的能源，包括生物质能生物液体燃料及利用生物质生产的能源如燃料酒精、生物柴油、生物质气化及液化燃料、生物制氢等(谭天伟，等，2003)。其中，生物柴油是采用来自动物或植物脂肪酸单酯包括脂肪酸甲酯、脂肪酸乙酯及脂肪酸丙酯等与甲醇(或乙醇)经酯交换反应而得到的长链脂肪酸甲(乙)酯，是一种可以替代普通石油柴油的可再生的清洁燃料，相较于其它种类的生物能源，生物柴油具有原料广泛、生产高效、环境友好、净化环境等突出特点(谭天伟，等，2002)。 

Chisti通过建立数学模型和工程计算指出微藻生物能源是唯一可以取代石化油的生物柴油(Chisti，et al.,2007；Chisti，et al.,2008)。因具有清洁、高效、环保、产油量大等优点，微藻生物能源被视为最具有发展潜力的生物柴油的资源(Metting，et al.,1996；Spolaore，et al.，2006；Weers，et al.，1977；Hu et al.,2008)。硅藻是海洋浮游生物最重要的组成成分，在提供海洋初级生产力方面发挥着重要的作用。它们是研究发现新颖的在其他经常研究的生物体中不存在的代谢路径的主要研究对象，因为在它们进化过程中形成一系列新颖的代谢路径(Armbrust,et al.,2004)。由于三角褐指藻具有生长周期短、生长快、脂质含量高等优点，成为最具潜力的产油微藻(Yang,et al.,2013；Niu,et al.,2012)。因此，通过遗传学改造提高三角褐指藻的脂质含量与生物量是提高工业化生产产量的重要途径。 

海洋硅藻三角褐指藻，一种广泛使用的饵料藻，其快速增长和高脂肪含量已成为有吸引力和有前途的，作为生物柴油的新来源，它的基因组在2008年已被测序(http://genome.jgi-psf.org/Phatr2/Phatr2.home.html)，使得它也成为研究功能基因组学一个模型微藻。 

载体元件是决定微藻表达系统中DNA表达稳定性的关键部件之一。随着基因组测序技术的快速进步，基因测通技术和序列信息注释已被开发用于传输序列功能性信息的渠道。通常，研究基因的功能可以使用各种的方法，如异位表达，基因沉默，蛋白质亚细胞定位，启动子活性分析，结构—功能分析，并在体内或体外用生物化学测定基因表达模式分析。然而，对基于限制性内切酶/连接酶克隆方法工程表达构建体的常规方法是非常费力和耗时的，并且经常受到限制性酶切位点的阻碍。在模型藻莱茵衣藻和三角褐指藻甚至大多数高等植物中载体构建是功能基因分析的主要障碍，因此，迫切需要创新和有效的技术手段克服以 上困难。最近的通路克隆系统用两步骤的位点特异性重组快速大规模克隆研究一个或者多个基因进入载体(G and J,2004)。需连入载体的DNA片段，首先克隆到一个普通供体载体。然后，由两个位点特异性重组位点(attB1和attB2位)中的供体质粒侧翼的DNA片段可以被精确地转印到各种表达载体中，通过位点特异性重组反应。一旦DNA产物被靶向到供体载体中，无需传统的限制性内切酶和连接酶克隆的简单反应。将重组克隆系统，DNA的转移构建体整合到表达目的载体所介导Gateway技术，和许多开放阅读框条目(供体)的克隆的集合和表达质粒已被广泛用于功能基因组学中的许多生物创建(Aliverti et al.,2008)。然而，在这种方式中使用的酶的成本相对昂贵，特别是相关技术几乎没有在硅藻三角褐指藻中报道，并且转化效率不高，因此通过利用选择标记基因构造微藻的遗传转化的零背景的TA克隆载体。此外，该技术可灵活地适应用于PCR扩增的基因或片段开发专门的表达载体的单步装配(Chen et al.,2009)。通过限制性内切酶XcmI的高效酶切，该质粒可以形成两个3'的T突出端以便用于TA克隆，我们这次构建的T载体基于限制性内切酶XcmI的灵活运用(Chen et al.,2009)，T载体连接方式几乎适用于所有的基因克隆连接工作，使得未来都省时省力连接目的基因到在三角褐指藻表达的载体。