[发明专利]一种果胶裂解酶BnPL基因及其启动子和应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术和植物基因工程领域。具体涉及一种果胶裂解酶BnPL及其编码基因和应用。

背景技术

油菜角果开裂是构成油菜减产的主要因素之一，也是当前机械化收获中最突出的问题。生产上由裂角造成的损失一般为10％-20％，当收获期遇到多雨和高温天气时损失将高达50％。油菜易裂角不利于机械化收获，提高油菜角果的抗裂角能力是机械化收获过程中急需解决的重大问题，加强油菜抗裂角性状的研究对油菜生产的可持续性发展具有重要意义。

果胶是植物细胞壁的主要组成部分，能在细胞之间的相互连接过程中发挥作用，在维持植物细胞壁的结构上具有重要意义。另外，果胶也能作用于植物的抗病性状和信号转导。果胶裂解酶基因是一类能降解果胶质的酶的总称，广泛存在于微生物和植物组织中，果胶裂解酶基因能通过对半乳糖醛酸的β碳原子上的基团进行转移和消除机制使半乳糖醛酸的α-1,4键断裂，是一种能降解细胞壁的裂解酶基因，在植物的生长和发育过程中，伴随着细胞壁的修饰和成分的改变与降解。果胶裂解酶基因通过降解细胞壁的果胶来发挥这一作用。在植物中，果胶裂解酶基因首先在番茄的花发育过程中被分离出来，且具有花发育特性。果胶裂解酶基因能降解花粉细胞壁中的果胶物质，从而导致花粉细胞壁的松弛而使花粉管萌发。在拟南芥中，果胶裂解酶基因不仅能影响组织的腐烂还能诱导拟南芥植株的抗病体系。

在跃变型果实中，果胶裂解酶基因能影响果实的硬度。在成熟香蕉的果实中分离出了两个果胶裂解酶基因基因Pel-1和Pel-2，这两个基因都只在成熟的角果中表达，在绿色的角果和叶，根中都不表达，显示这两个果胶裂解酶基因在果实的成熟和软化过程中具有重要作用。在草莓中构建了35S启动子驱动的反义表达果胶裂解酶基因基因的载体转化草莓，在反义表达果胶裂解酶基因基因的阳性草莓株系中，果胶裂解酶基因基因的表达水平比对照低30％，表型体现为其产量降低，成熟果实果胶裂解酶含量比对照低，果实更硬。对其中的2个转反义基因的转基因株系进行了细胞学结构观察，发现转反义果胶裂解酶基因的果实中细胞之间间隙比对照要小，两个相邻细胞之间的结合能力更强，果实更耐存储。这些实验证明果胶裂解酶基因能控制相邻细胞之间的连接，对维持果实细胞间的结合能力具有重要作用。

由于甘蓝型油菜裂角涉及到离区细胞的降解，果胶裂解酶基因在油菜角果发育中可能起到一定的作用，因此通过反向遗传学的方法研究果胶裂解酶基因基因的功能，对创造和培育抗裂角性强的油菜品种具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的是在于提供了一种果胶裂解酶BnPL基因，本发明提供了这个基因的核苷酸序列和其蛋白质的氨基酸序列。该基因参与细胞分离过程，利用反义技术操作BnPL基因能够创造抗裂角的植物材料。

本发明的另一个目的是在于提供了一种果胶裂解酶BnPL基因的制备方法，该方法根据拟南芥的果胶裂解酶基因(AT5G15110)的序列在甘蓝型油菜EST序列数据库中找到了三个匹配较好的序列，根据这三个EST序列设计引物，以甘蓝型油菜cDNA为模板进行PCR，对PCR产物进行测序后，根据扩增出的序列片段设计RACE引物进行RACE反应，扩增全长cDNA序列，从而得到全长cDNA序列。以全长cDNA序列设计特异引物，以油菜基因组DNA为模板扩增BnPL基因的全长序列。

本发明的再一个目的是在于提供了一种果胶裂解酶BnPL基因启动子的制备方法，根据果胶裂解酶BnPL基因的全长序列设计引物，通过基因组步移法在甘蓝型油菜品系R2中扩增并拼接出果胶裂解酶BnPL启动子序列。根据拼接出的果胶裂解酶BnPL启动子的拼接序列设计特异引物，扩增出该基因的启动子全长序列。

本发明的再一个目的是在于提供了一种果胶裂解酶BnPL基因在提高植物抗裂角性中的应用途径。

本发明的技术方案通过以下方法实现：

一种果胶裂解酶BnPL基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，总长度1416bp，共编码471个氨基酸。

一种果胶裂解酶BnPL基因，其表达蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

所述的果胶裂解酶BnPL基因在提高植物抗裂角性中的应用。

所述的果胶裂解酶BnPL基因的启动子，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

所述的果胶裂解酶BnPL基因启动子在植物角果发育调控中的应用。

1、一种果胶裂解酶BnPL基因通过以下步骤获得：