[发明专利]重组ULP1激酶的编码序列、编码蛋白、含有该编码序列的质粒、及重组ULP1激酶的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种重组ULP1激酶的编码序列、编码蛋白、含有该编码序列的质粒、及重组ULP1激酶的制备方法。 

背景技术

多肽或者蛋白质在大肠杆菌中的融合表达是非常常见的技术，但是为了将目的多肽或者蛋白从融合蛋白中释放出来，往往需要使用价格不菲的蛋白激酶或者利用内含肽的自断裂。内含肽的自断裂对目的多肽的N端或C端的第一个氨基酸有偏好性，且断裂效果不稳定，因此目前主要是使用各类蛋白激酶来切割融合蛋白，从而释放出目的多肽(蛋白质)。 

目前常见的切割融合蛋白的蛋白激酶有凝血酶，因子10蛋白，肠激酶，TEV激酶，PreScission激酶，TAGZyme激酶，HRV3C激酶，ULP1激酶。不过考虑到切割产物是否会产生多余氨基酸、切割效率、以及切割位点的特异性这三方面因素，我们发现只有肠激酶与ULP1激酶符合该条件。肠激酶是识别Asp-Asp-Asp-Asp-Lys结构，而ULP1激酶却是识别100个氨基酸的SUMO标签形成的二级结构，因此ULP1激酶具有更好的切割特异性。同时SUMO标签除了作为ULP1激酶的切割识别位点，也可以做为助溶标签使用，可以减小整个融合蛋白的长度。综合以上的结论，我们认为ULP1激酶是目前为止最优的蛋白切割酶类，具有最好的切割活性以及切割位点的特异性。通过调研国内相关专利，我们发现国内还没有ULP1激酶制备的相关专利。国外相关文献中，虽然有相关报道，但是其制备工艺较为复杂而且纯度较低。 

发明内容

本发明旨在克服现有技术的不足，提供一种重组ULP1激酶的编码序列、编码蛋白、含有该编码序列的质粒、及重组ULP1激酶的制备方法。 

为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为： 

所述重组ULP1激酶的编码序列如SEQ ID NO.1所示。 

所述质粒含有SEQ ID NO.1所示的编码序列，优选地，所述质粒为pCD-ULP1，其全序列如SEQ ID NO.2所示。 

所述蛋白序列如SEQ ID NO.3所示。 

所述重组ULP1激酶的制备方法包括如下步骤： 

(1)根据大肠杆菌密码子使用偏好，对ULP1_(403-621)这部分蛋白所对应的编码基因进行优化，优化设计并合成后的编码序列如SEQ ID NO.1所示；将SEQ ID NO.1所示的序列通过酶切方式接入表达载体pCold-II，得到质粒pCD-ULP1； 

通过分析国内外文献，我们发现来自于酿酒酵母的ULP1激酶一共含有621个氨基酸，但是只需要保留403-621这一区域的氨基酸，即可保留该激酶对SUMO标签的特异性识别与切割活性，本发明所涉及的ULP1激酶制备均是指403-621这部分活性区域的制备； 

(2)将质粒pCD-ULP1转入大肠杆菌，37℃倒置培养过夜； 

(3)挑取单菌落至505培养基，于37℃条件下进行种子培养7—9h； 

(4)将种子培养基接入5052培养基，接种量为0.08—1.2％，于16—37℃诱导培养16—72h后离心收集菌体； 

(5)将收集的菌体超声破碎后过镍柱纯化：首先过PBS平衡镍柱，然后用咪唑洗脱重组的ULP1激酶，再将洗脱出的重组ULP1激酶脱盐并收集保存。 

优选地，步骤(2)所述大肠杆菌为大肠杆菌BL21(DE3)，也可以为其他本领域常用的其他菌种。 

步骤(3)种子培养时的摇床转速为220rpm。 

步骤(4)所述离心条件是4℃、5000rpm、离心30min。 

所述步骤(5)是将收集的菌体用PBS悬浮，然后将悬浮的菌体在功率30％、开5s停12s条件下超声破碎30min，再将破碎后的菌体于4℃、15000rpm条件下离心30min后过镍柱纯化。所述咪唑洗脱是用50mM咪唑和200mM咪唑各洗脱一次后再用400mM咪唑洗脱；然后将洗脱液加入超滤管中，于4℃、5000rpm条件下离心30min进行脱盐。 

上述505与5052培养基配方参见Protein Expr Purif41,207-234.(2005)。 

本发明中所涉及的其他各种实验操作，均为本领域的常规操作技术，文中没有特别说明的部分，本领域的普通技术人员可以参照本发明申请日之前的各种常用工具书、科技文献或相关的说明书、手册等加以实施。 

与现有技术相比，本发明的有益效果为：