[发明专利]一种糖基化肽段固相富集并质谱分析的方法

说明书

本发明属蛋白质分析领域，涉及一种利用氨氧基修饰的磁性纳米材料富集糖基化肽的新方法，其包括：首先对糖肽上的羟基进行高碘酸纳NaIO₄氧化使得羟基变为醛基，再将氨氧基修饰的磁性纳米材料Fe₃O₄@ONH₂置于氧化后的糖肽溶液中，通过氨氧基基团和糖肽中糖链氧化后得到的醛基之间反应，将糖肽固定在磁性纳米材料上，随后将未和纳米材料反应的非糖肽清洗除去,最后再利用去糖链酶将捕获的糖肽从材料上解离下来，送入质谱分析糖基化肽。本发明方法步骤简单、操作方便、快速高效，可以实现糖基化肽的高灵敏、高选择性质谱分析。

技术领域

本发明属蛋白质分析领域，涉及一种糖基化肽段固相富集并质谱分析的方法，尤其是利用氨氧基修饰的磁性纳米材料富集糖基化肽并质谱分析的新方法。本发明方法能显著地提高糖基化肽的分析质谱选择性，并且具有步骤简单、操作方便、快速等特点。

背景技术

现有技术公开了蛋白质糖基化是生物体内组普遍存在的一种翻译后修饰，执行着重要的生物学功能。糖基化修饰在各种生命现象中都起着重要的作用，如参与细胞黏附及信号转导，影响蛋白质的分泌和稳定性，免疫及炎症反应以及影响蛋白质在细胞内的转送方向等。据研究报道，生物体内约有1/2以上的蛋白质会发生糖基化，高灵敏地鉴定生物体内的糖基化后修饰位点是实现其进一步研究的首要前提，然而，它们的研究都面临着类似的困难，首先，糖基化修饰的蛋白质种类虽然很多，但其丰度却通常较低，并且其酶解成肽段后占全部肽段的比例更低，通常只有2-5％左右的肽段带有糖基化修饰；第二，带有糖基化修饰的肽段在质谱中的离子化效率往往比非修饰肽段低，因而不易被质谱鉴定；第三，糖链本身的微观不均一性导致糖肽在质谱中的信号分散和减弱，更加难以被质谱高灵敏鉴定；第四，尽管目前已有基于肼腙反应糖基化肽固相富集方法，但所述的富集方法存在有如下缺陷：通常耗时较长，富集时间至少12小时以上，并且肼基团大多固定于树酯载体上，捕获糖肽后从溶液中的分离十分不易等等。因此，本申请的发明人拟提供一种反应更加特异和更加方便固液的分离的糖基化肽的固相富集方法，该方法将有利于实现高选择性和高灵敏度质谱鉴定，从而进一步促进糖蛋白质的研究。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的存在的缺陷，提供一种步骤简单、操作方便、快速高效，实现糖基化肽选择性富集和高灵敏度质谱鉴定的新方法。

本发明提供了一种糖基化肽段固相富集并质谱分析的方法，尤其是利用氨氧基修饰的磁性纳米材料富集糖基化肽并质谱分析的方法。本发明利用氨氧基修饰的磁性纳米材料Fe₃O₄@ONH₂上的氨氧基基团和糖肽中糖链氧化后得到的醛基之间的反应，将糖肽固定在磁性纳米材料上,而非糖肽则被清洗除去,最后再利用去糖链酶将糖肽从材料上解离下来,从而实现磷酸化肽段的选择性富集并质谱分析。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

1.对肽段样品进行NaIO4氧化；

2.对其中的糖基化肽段进行富集；

3.将糖基化肽从磁性纳米材上洗脱下来送入质谱分析。

具体的，本发明的一种固相富集糖基化肽段并质谱分析的方法，其特征在于，采用氨氧基修饰的磁性纳米材料Fe₃O₄@ONH₂为吸附剂，实现糖基化肽的选择性富集；其包括步骤：

(1)对多肽样品进行高碘酸钠氧化，使糖肽上糖链中的羟基氧化成为醛基；

(2)加入Fe₃O₄@ONH₂材料与多肽溶液充分混合；

(3)外加磁场，使得磁性材料和溶液分离，收集下层固体相；

(4)用缓冲液清洗材料，清洗后外加磁场将材料和溶液分开，收集材料；