[发明专利]无标记电化学发光肿瘤标志物免疫传感器的制备和应用

权利要求书

1.无标记电化学发光肿瘤标志物免疫传感器的制备方法，其特征在于，制备步骤为：

（1）金 @ 银核壳纳米棒 – 鲁米诺 – 壳聚糖复合材料（Au@AgNRs-Lum-Chi）的制备

将20mL金纳米棒溶胶（AuNRs）和20mL 0.05~0.2 mol/L的十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）溶液混合，在30~45℃下搅拌，并顺序加入3~6 mL 0.1 mol/L的 L-抗坏血酸（AA）溶液、0.5~1 mL 0.05 mol/L的硝酸银（AgNO₃）溶液和 3~6 mL 0.1 mol/L的氢氧化钠（NaOH）溶液，停止搅拌，静置1~3h，离心分离，将产品重新分散到20mL 水中，得到金 @ 银核壳纳米棒溶胶（Au@AgNRs）；

将3~5 mL的Au@AgNRs和 3~5 mL 1×10^-3 mol/L的鲁米诺（Lum）溶液混合，搅拌1~3h，离心分离，将产品重新分散到5mL质量分数为0.3 ~ 0.7 %的壳聚糖（CHi）溶液中，得到Au@AgNRs-Lum-Chi溶液；

所述的AuNRs是20~40nm长的棒状金纳米粒子的水溶液；

所述的Chi溶液是将Chi纯品加入到体积分数为1% 的醋酸中制备而成；

（2）磷酸钴铵片状材料（NH₄CoPO₄）的制备

在40mL水中加入2.0~4.0 g铵盐和0.15~0.25 g磷酸盐，完全溶解后，加入0.15~0.25 g氯化钴，在30~45℃下搅拌10~14h，离心分离，将产品置于50℃下干燥，即得到NH₄CoPO₄；

所述的铵盐选自下列之一：氯化铵、溴化铵、磷酸铵、磷酸二氢铵、磷酸氢二铵；

所述的磷酸盐选自下列之一：磷酸铵、磷酸二氢铵、磷酸氢二铵；

（3）无标记电化学发光肿瘤标志物免疫传感器的制备方法

1）对工作电极进行预处理：将直径4 mm的玻碳电极依次用1.0、3.0和0.05 μm的三氧化二铝抛光粉抛光处理，依次用乙醇和超纯水进行超声清洗；

2）在1）中得到的电极表面滴加5~10 μL 1~5 mg/mL的NH₄CoPO₄水溶液，室温下自然晾干； 

3）在2）中得到的电极表面滴加5~10 μL的Au@AgNRs-Lum-Chi溶液，4 ℃ 冰箱中保存晾干，超纯水清洗，晾干成膜，4 ℃保存；

4）在3）中得到的电极表面滴加5~8 μL 10 μg/mL的肿瘤标志物抗体溶液，4 ℃ 冰箱中保存晾干；

5）在4）中得到的电极表面滴加4~6 μL 100 μg/mL的牛血清白蛋白（BSA）溶液，4 ℃ 冰箱中保存晾干，超纯水清洗，晾干成膜，4 ℃保存，制得无标记电化学发光肿瘤标志物免疫传感器。

2.如权利要求1所述的无标记电化学发光肿瘤标志物免疫传感器，用于肿瘤标志物的检测，步骤如下：

1）将已知浓度的肿瘤标志物抗原标准溶液加入到40~60 μL、pH=7.0~8.0的PBS缓冲溶液中，制得抗原混合溶液，取5~10 μL抗原混合溶液滴涂到所制备的无标记电化学发光肿瘤标志物免疫传感器的工作电极上，在4 ℃ 冰箱中保存晾干，pH=7.0~8.0的PBS缓冲溶液清洗后，晾干，4 ℃保存；

2）以饱和甘汞电极作为参比电极、铂丝电极作为对电极，与1）中组装的工作电极组成三电极系统，连接到电致化学发光设备上；在电解槽中先后加入10~25mL pH=7.0~8.0的PBS缓冲溶液和1mL 3~6 mmol/L的过氧化氢（H₂O₂）溶液；用循环伏安法对组装的工作电极施加循环电压；根据所得的电致化学发光的光信号强度与肿瘤标志物抗原标准溶液浓度之间的关系，绘制工作曲线；

3）将待测样品溶液代替肿瘤标志物抗原的标准溶液，按照所述肿瘤标志物抗原的工作曲线的绘制方法进行检测。

3.如权利要求1和2所述的无标记电化学发光肿瘤标志物免疫传感器的制备和应用，其特征在于所述肿瘤标志物选自下列之一：癌胚抗原（CEA）、前列腺特异性抗原（PSA）、CA-125、CA-199、CA-242、CA-724、甲胎蛋白（AFP）、鳞状细胞癌抗原（SCC）。