[发明专利]植物基因组定点修饰方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及RNA引导的植物基因组定点修饰方法。

背景技术

过去十多年里，序列特异性核酸酶的发明和改进已经在创建定点突变方面展现出了强大威力。锌指核酸酶(Zinc finger nucleases，ZFNs)和类转录激活因子效应物核酸酶(Transcription activator-like effector nuclease，TALENs)即是其中的主要代表(Carroll et al.,2006；Christian et al.,2010)。它们是识别一段特定核酸序列的结合结构域阵列与一种非特异性核酸酶Fok1组成的融合蛋白。这些蛋白切割核酸序列产生双链断裂以后，生物体会通过非同源末端连接或者同源重组两种机制进行修复，从而引入定点改变或修饰。上述技术已经在多个物种里获得成功应用，包括线虫，人细胞，老鼠，斑马鱼，玉米，水稻，短柄草等(Beumer et al.,2006；Meng et al.,2008；Shukla et al.,2009；Meyer et al.,2010；Cui et al.,2011；Mahfouz et al.,2011；Li et al.,2012；Meyer et al.,2012；Shan et al.,2013；Weinthal et al.,2013)。然而，这些技术的最大缺陷是通过蛋白元件来识别特定核酸序列，构建比较麻烦，识别特异性有待提高。

2012年人们发现并改进了一种突破性的新技术，CRISPR/Cas。CRISPR(clustered regulatory interspaced short palindromic repeats)，是一段被一种短重复序列分隔的核酸序列，它们转录形成的CRISPR RNA(crRNAs)与另一种反式作用型crRNA(trans-activating crRNA，tracrRNA)部分区域配对形成二元复合体。然后，该二元复合体一起引导具有非特异核酸酶活性的Cas蛋白，切割与crRNAs匹配的DNA序列，从而形成双链断裂。

此外，人们进一步将crRNAs与tracrRNA融合在一起，形成单一的chimeric RNA(chiRNA)分子，并发现chiRNA同样能介导Cas9蛋白切割目的序列(Jinek et al.,2012)。这种可编辑型CRISPR/Cas系统很快在多个物种里面取得成功应用，包括人细胞系，斑马鱼，大肠杆菌和老鼠等(Jinek et al.,2012；Hwang et al.,2013；Jiang et al.,2013；Jinek et al.,2013；Mali et al.,2013；Shen et al.,2013；Wang et al.,2013)。这项技术的最大优势是构建简易，而且可以同时对多个目标位点基因修饰。对于动物，可将chiRNA和Cas9的体外转录产物直接施用(如通过注射)于动物，从而引起基因突变。在老鼠中，已有同时对多达5个目标位点基因突变的成功报道。然而，由于种种未知的原因，目前尚未在植物中成功开发和应用类似的技术。

综上所述，为了植物基因工程的需要，本领域迫切需要开发简便高效的植物基因组的定点修饰方法。

发明内容

本发明的目的就是简便高效的植物基因组的定点修饰方法。

本发明的另一目的是提供适用于植物的CRISPR/Cas技术，并在稳定植株中实现特异DNA序列的切割。

在本发明的第一方面，提供了一种植物基因组定点修饰方法，包括步骤：

(a)将一表达嵌合RNA和Cas蛋白的核酸构建物导入植物细胞，获得转化的植物细胞，其中所述嵌合RNA是由特异性识别待定点修饰(或待切割位点)的CRISPR RNA(crRNAs)和反式作用型crRNA(trans-activating crRNA，tracrRNA)所构成的嵌合体(chimera)；和

(b)在合适的条件下，使转化的植物细胞中的所述核酸构建物转录形成嵌合RNA(chiRNA)，并且使所述转化的植物细胞表达所述的Cas蛋白，从而使得在所述嵌合RNA的引导下，在所述转化的植物细胞中，通过所述Cas蛋白对基因组DNA进行定点切割，从而进行基因组定点修饰。

在另一优选例中，所述的定点修饰包括定点随机修饰和定点非随机修饰(定点精确修饰)。