[发明专利]一种E2F3基因沉默对前列腺癌动物模型中全血E2F3影响的方法

权利要求书

1.一种E2F3基因沉默对前列腺癌动物模型中全血E2F3影响的方法，其特征在于，该E2F3基因沉默对前列腺癌动物模型中全血E2F3影响的方法包括：

步骤一，通过收集不同前列腺癌石蜡标本，采用real-timePCR、WESTERN、免疫组化，分析E2F3及其所调基因在前列腺癌中的表达情况；

步骤二，建立以AVV为载体的RNAi平台，并分析干扰序列对前列腺癌LNCaP细胞中E2F3基因沉默的影响；

步骤三，并经体外实验证实E2F3基因沉默对LNCaP细胞中E2F3及相关调控基因的影响及对细胞增殖及凋亡的影响；应用裸鼠进行原位前列腺癌动物模型的构建；

步骤四，应用AAV干扰载体进行肿瘤的局部注射后明确肿瘤组织中E2F3在mRNA及蛋白质水平的表达情况及对肿瘤生长抑制情况，最后应用实时定量PCR进行全血E2F3mRNA的检测，明确作为前列腺癌肿瘤标记物的可能性。

2.如权利要求1所述的E2F3基因沉默对前列腺癌动物模型中全血E2F3影响的方法，其特征在于，该E2F3基因沉默对前列腺癌动物模型中全血E2F3影响的方法具体包括以下步骤：

第一步，取不同临床分期、病理分级的前列腺癌石蜡切片组织进行免疫组化染色，在蛋白质水平研究E2F3及AR的表达情况及二者的表达与前列腺癌临床特点及预后之间的关系，根据Gleason分级和评分标准进行病理分级并根据Whitmore-Jewett系统进行临床分期；

第二步，合成三对针对于E2F3基因的siRNA对应模版DNA序列，通过RT-PCR方法筛选出最为有效的干扰片段；根据筛选结果，将相应shRNA表达框克隆到腺相关病毒载体中，包装纯化病毒后，转染膀胱移行细胞癌肿瘤细胞株，检测病毒载体的长效基因沉默的效果，以及细胞增殖凋亡相关指标；

第三步，采用LNCaP细胞在裸鼠前列腺前页进行接种，建立原位前列腺癌动物模型。

3.如权利要求2所述的E2F3基因沉默对前列腺癌动物模型中全血E2F3影响的方法，其特征在于，取不同临床分期、病理分级的前列腺癌石蜡切片组织进行免疫组化染色，在蛋白质水平研究E2F3及AR的表达情况及二者的表达与前列腺癌临床特点及预后之间的关系；根据Gleason分级和评分标准进行病理分级并根据Whitmore-Jewett系统进行临床分期。

4.如权利要求2所述的E2F3基因沉默对前列腺癌动物模型中全血E2F3影响的方法，其特征在于，针对E2F3的AAV干扰穿梭质粒的构建及病毒的包装、浓缩与纯化包括以下步骤：

步骤一，对已制备的E2F3RNAi质粒载体进行双酶切，插入干扰片断后，将U6-RiE2F3序列PCR后克隆进T载体，然后亚克隆至pAAV-MCS；酶切、PCR、测序验证载体构建成功并证明ITR的存在；

步骤二，待AAV-293细胞达到70％-80％融合后，分别将干扰穿梭质粒与pRC、pHelper按照1：1：1浓度与细胞电转，24小时后收集细胞；

步骤三，采用氯仿处理-PEG/NaCl沉淀-氯仿抽提三个步骤分离、浓缩、纯化病毒；

步骤四，应用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测病毒纯度；将纯化的病毒经钨酸盐染色后，置于150目的镍网上，扫描电镜观察。

5.如权利要求2所述的E2F3基因沉默对前列腺癌动物模型中全血E2F3影响的方法，其特征在于，含有干扰序列的rAAV对E2F3及相关调控基因表达影响的方法包括：

步骤一，对LNCaP细胞进行病毒转染，通过绿色荧光的观察、重组病毒载体与质粒载体在转化效率、沉默效率、细胞毒性；

步骤二，rAAV干扰载体对LNCaP细胞中E2F3及ARmRNA及蛋白质表达水平的影响；

步骤三，接种LNCaP细胞于24孔板中，待细胞80-90％融合，弃培养液，并向每孔中分别加入不同浓度的rAAV-U6-RiE2F3-GFP，分别提取总RNA和总蛋白，观察干扰效果，不同浓度及不同作用时间的rAAV-RiE2F3干扰载体对LNCaP细胞中E2F3沉默的影响及细胞杀伤作用；

步骤四，应用流式细胞术研究rAAV-U6-RiE2F3-GFP转染前后LNCaP细胞细胞周期及凋亡的变化情况。