[发明专利]获得人源OPCs的方法和OPCs培养基有效

专利信息
申请号: 201410336947.X 申请日: 2014-07-16
公开(公告)号: CN104073468A 公开(公告)日: 2014-10-01
发明(设计)人: 栾佐 申请(专利权)人: 栾佐
主分类号: C12N5/0797 分类号: C12N5/0797
代理公司: 暂无信息 代理人: 暂无信息
地址: 100048 北京*** 国省代码: 北京;11
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摘要:
搜索关键词: 获得 opcs 方法 培养基
【说明书】:

技术领域

发明涉及获得人源OPCs的方法和OPCs培养基。

背景技术

脑白质损伤、脊髓损伤、多发性硬化等髓鞘相关疾病由于神经元的髓鞘化障碍或脱髓鞘化,导致了神经元不能正常传递电兴奋,从而导致机体运动等功能失能。由于目前还没有任何一种药物可以有效地治疗这些髓鞘相关疾病,这给这些疾病的患者及家庭带来了极大的伤害,这使得有效治疗髓鞘相关疾病成为当今急待解决的社会和医学难题。

不论是髓鞘化障碍还是脱髓鞘病变,其根源都是神经元轴突髓鞘程度减少或丢失,因此如果能够恢复神经元轴突的髓鞘化程度,使得神经元电流得以稳定快速地传导,理论上这些疾病就可以被治愈。研究发现,少突胶质前体细胞(oligodendrocyte progenitor cells,OPCs)是负责中枢神经系统髓鞘化的关键细胞,在中枢神经系统中,OPCs可以分化为少突胶质细胞(oligodendrocyte,OL),OL进一步包绕神经元轴突形成完整的髓鞘结构,从而保证神经元电流的稳定快速传导。髓鞘相关的疾病一方面是因为疾病破坏了已经形成的髓鞘结构;另一方面更是由于神经系统中OPCs受到了损伤,使得OL失去了源泉。少突胶质细胞减少,导致脑白质髓鞘化延迟或被破坏,从而使得神经电信号传导异常或者轴突受损,导致神经功能损伤。

对脱髓鞘病变患者来说,由于内源性OPCs大量丢失,要促进脑中髓鞘的再生,植入外源成髓鞘细胞是一个有希望的治疗方法。由于OPCs是中枢神经系统中成髓鞘细胞的天然来源,OPCs移植可能对治疗脱髓鞘病变起到很好的疗效。实验发现,将啮齿类动物的OPCs移植到新生的啮齿类动物脑内,植入细胞能在宿主脑内广泛迁移、增殖并分化为成熟OL,形成包绕轴突的髓鞘结构并恢复神经功能,表明外源植入OPCs能发挥与内源OPCs同样的功能,OPCs移植可能是治疗髓鞘损伤疾病的一个新的方向,这对脱髓鞘病变治疗具有积极的意义。

尽管啮齿类动物的OPCs很容易获得,人源OPCs获得却相当困难。依赖于免疫表型,通过流式细胞术或是免疫磁珠技术从胎儿中枢神经系统组织或是成人脑白质组织中分选可以得到OPCs。Windrem等从胎儿或是成人脑组织中分离出了A2B5+PSA-NCAM-表型的细胞,认为该细胞即为OPCs,将该细胞移植入先天脱髓鞘的小鼠内,可以形成髓鞘。然而由于人源的供体组织较少,分离得到的OPCs数量相当有限,且其存在伦理学问题,因此距离临床应用还非常遥远。另一种可以通过胚胎干细胞或是神经干细胞定向诱导分化获得人源OPCs。美国的Hans等人研究发现,胚胎干细胞体外可以分化为OPCs,且OPCs移植有助于脊髓损伤的神经功能恢复,该方法在美国进入了临床I期的治疗研究。但胚胎干细胞的全能性是把双刃剑,既能分化为各种细胞,也有致瘤的风险,因此该方法获得的OPCs在临床应用上还存在一定的致瘤风险。神经干细胞是一种成体干细胞,由于成体干细胞分化能力受到限制,在一定程度上避免了致瘤的风险,临床应用上更为安全。但这两种细胞的诱导过程都需要较长时间及多种细胞因子的共同作用,这必然导致培养的费用增加,限制细胞的产量。

因此,临床的治疗研究需要一种简单获得且经济培养人源OPCs的方法。神经干细胞体外有分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的能力,且约有16%的细胞表达A2B5+PSA-NCAM-表型,同时由于是成体干细胞又在一定程度上避免了致瘤的风险。神经干细胞还可以在体外大量扩增,可以说神经干细胞是很好的分选OPCs的来源。

发明内容

本发明的目的是解决上述问题,提供一种获得人源OPCs的新方法。为此,申请人经过深入研究,将神经干细胞(不论是低代数还是较高代数)作为分选来源,通过免疫磁珠的方法分离得到人源OPCs,并找到了适合OPCs体外培养和传代的较经济型的培养基,可以在短时间内获得大量的高纯度的人源OPCs,为临床应用提供了新的选择。

本发明提供的获得人源OPCs的方法为,将神经干细胞作为分选来源,通过免疫磁珠的方法分离得到人源OPCs,采用的磁珠为Anti-PSA-NCAM磁珠。

优选地,包括以下步骤:

①神经干细胞在胰蛋白酶溶液中被消化成单个细胞,过筛网;

②离心收集细胞,去上清;

③细胞重悬在磁珠分选缓冲液中,混匀后在2-8℃中温育;

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