[发明专利]高产N-乙酰氨基葡萄糖代谢工程菌及其构建方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种高产N-乙酰氨基葡萄糖代谢工程菌及其构建方法和应用。

背景技术

N-乙酰氨基葡萄糖是葡萄糖的衍生物，广泛存在于各种生物体内。通常以beta-1,4-糖苷键聚合成几丁质。几丁质是自然界中数量仅次于纤维素的第二大类碳水化合物，存在于低等植物菌类、藻类的细胞，节肢动物虾、蟹、昆虫的外壳，高等植物的细胞壁等。除了作为几丁质的组分，N-乙酰氨基葡萄糖还与N-乙酰胞壁酸通过多肽相互交联，构成细菌细胞壁的主要结构-肽聚糖，也与D-葡萄糖醛酸形成重复的二糖单位而构成透明质酸。

N-乙酰氨基葡萄糖医药上作为抗菌消炎药物，用于治疗风湿性关节炎症和治疗胃溃疡疾病，若与抗生素一起使用，可促进抗生素在血液中的吸收，降低副反应同时也可抑制癌细胞的生长，是合成新型抗癌药物氯脲霉素的主要原料。食品方面，N-乙酰氨基葡萄糖是婴儿配方乳中添加的一种重要微量糖类成分，也是合成VB₆和核黄素中间体的起始原料。此外，还可应用于化妆品和饲料添加剂中，用途十分广泛。

N-乙酰氨基葡萄糖的生产目前主要是利用氨基葡萄糖和乙酸酐经化学缩合反应而成，存在成本过高、收率低、纯度不足等缺陷。因此，国内外开展了利用微生物发酵法生产N-乙酰氨基葡萄糖的工作。

美国阿基昂生命科学公司(Arkion Life Sciences LLC)利用代谢工程构建了一系列代谢工程菌，通过优化发酵参数，获得了高产N-乙酰氨基葡萄糖的生产工艺(WO2004003175，US7332304和CN101365785A等)，该专利中，通过向大肠杆菌引入并过表达6-磷酸氨基葡萄糖乙酰化酶，敲除N-乙酰氨基葡萄糖消耗基因，打通葡萄糖到氨基葡萄糖的代谢途径，构建了高产N-乙酰氨基葡萄糖的工程菌。中国专利申请号201110174246.7(CN102286420A)和201110174249.0(CN102268399A)通过上述类似的方式，构建了两株N-乙酰氨基葡萄糖的生产菌株。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高产N-乙酰氨基葡萄糖代谢工程菌，本发明的另一目的在于提供该工程菌的构建方法，以及在生产N-乙酰氨基葡萄糖中的应用。

本发明通过构建新的高产N-乙酰氨基葡萄糖的基因工程大肠杆菌，提高了N-乙酰氨基葡萄糖的产量。

为解决上述技术问题，本发明的产(高产)N-乙酰氨基葡萄糖代谢工程菌，是通过将高表达编码UDP-N-乙酰氨基葡萄糖差向异构酶基因(如neuC1基因)和高表达编码6-磷酸氨基葡萄糖合成酶基因(如glmS基因)导入大肠杆菌表达，并敲除大肠杆菌中的N-乙酰氨基葡萄糖分解利用代谢途径酶的基因(如基因簇nagDCABE)构建而成的重组大肠杆菌。

所述UDP-N-乙酰氨基葡萄糖差向异构酶基因来源于空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)或能表达相同功能酶的微生物，基因的获得可根据GenBank No.AF400048基因序列全基因合成，或利用空肠弯曲菌(如菌株ATCC43438)的基因组DNA为模板通过PCR扩增获得，或采用过类似手段从其他生物体获得。

所述6-磷酸氨基葡萄糖合成酶基因来源于大肠杆菌或能表达相同功能酶的微生物，6-磷酸氨基葡萄糖合成酶基因的获得可根据GenBank No.NC_007779的大肠杆菌W3110基因组序列，经全基因合成得到，或利用大肠杆菌基因组DNA为模板通过PCR扩增获得，或采用过类似手段从其他生物体获得。

所述UDP-N-乙酰氨基葡萄糖差向异构酶基因和6-磷酸氨基葡萄糖合成酶基因导入大肠杆菌表达，是将这两个基因克隆到表达载体上后，以质粒的方式在大肠杆菌中表达，或将两个基因整合到大肠杆菌染色体上表达。

上述高产N-乙酰氨基葡萄糖代谢工程菌的构建方法，具体步骤包括：敲除大肠杆菌中的nagDCABE基因簇，将neuC1和glmS基因分别克隆到表达载体上，转入敲除了nagDCABE基因簇的大肠杆菌中，获得高产N-乙酰氨基葡萄糖代谢工程菌。其中，该构建方法，更加具体的步骤包括：

A、敲除大肠杆菌中的基因簇nagDCABE，获得基因簇nagDCABE失活的菌株；

B、全基因合成编码UDP-N-乙酰氨基葡萄糖差向异构酶的neuC1基因(SEQ ID NO.5)，并克隆表达载体；