[发明专利]一种直接针对组胺的半抗原、人工抗原、抗体及其制备方法与应用

说明书

技术领域

本发明属于食品安全免疫检测技术领域，更具体地，涉及一种直接针对组胺的半抗原、人工抗原、抗体及其制备方法与应用。

背景技术

组胺又名组织胺，化学名称为4 -(5) - (2-氨乙基)咪唑，是一种广泛存在于各生物体组织中的胺类物质。生物体中的组氨酸经过组胺酸脱羧酶的作用形成组胺，组胺是生物胺中对人体健康影响最大的物质。组胺—般很容易代谢，但如果摄入由于细菌的污染导致食物中组胺的含量水平超过人体对其代谢能力时，就会对机体产生危害。组胺中毒是水产食品存在的主要安全问题之一，世界各地尤其是沿海地区组胺中毒事件时有发生。组胺可引起头痛、瘙痒性皮疹、低血压等一系列过敏反应，对消化道有强烈的刺激作用，可造成肠胃出血、糜烂，其在动物源性食品中的残留直接威胁到人类身体健康。鉴于此，美国FDA要求进口水产品组胺不得超过50 mg/kg；欧盟规定鲭科鱼类中组胺含量不得超过100 mg/kg；我国规定鲐鱼中组胺不得超过1000 mg/kg；其他海水鱼不得超过300 mg/kg。目前国内外检测组胺的常用方法主要集中在仪器方法如高效液相色谱-质谱联用、毛细管电泳等方法，这些方法样品预处理要求高、步骤复杂、操作需专业人员、检测费用高、所依赖仪器昂贵复杂、费时费力，很难满足在许多场合中快速检测组胺的需要，在应用上不能得到有力的推广。

 基于抗原-抗体特异性结合的免疫分析法具有样品前处理简便、操作简单、快速、灵敏、高通量等特点，被誉为是21世纪最具竞争和挑战的快速检测技术，在食品安全领域具有广阔的应用前景。但是，对于免疫分析法而言，抗体作为核心是决定整个方法性能的重要基础，而抗体的效果很大程度上又取决于引起相应动物发生免疫反应的抗原结构。由于组胺分子质量非常小（111.14 Da），得到高特异性且针对组胺的抗体一直是有关学者致力解决的难题。

1984年，Mital等人在《Agents and Actions》发表题为An attempt to produce an antibody of histamine and histamine derivatives的文章，他们首先尝试了用牛血清蛋白（BSA）-丁二酰组胺偶联物作为免疫原去免疫大白兔，得到的血清含有抗BSA的抗体，没检测到识别半抗原（组胺）的抗体；接着，他们又将BSA与对-[2-(N-三氟乙酰组胺)偶氮基]苯甲酸偶联免疫兔子，得到了对三氟乙酰组胺有一定识别的抗体，然而该抗体对含三氟乙酰基的化合物都有一定的识别，不适合用于建立免疫分析方法。1986年，Guesdon等人在《Journal of Immunological Methods》发表题为Monoclonal anti-histamine antibody：preparation，characterization and application to enzyme immunoassay of histamine1的文章，他们选择通过对苯醌将组胺与BSA偶联免疫Balb/c小鼠得到一株分泌针对组胺与苯醌复合物的单克隆抗体的杂交瘤细胞；所述杂交瘤细胞产生的抗体对组胺苯醌复合物的亲和力达到约1.3×10⁹ L/mol。但是，采用对苯醌与组胺衍生化副反应很多，反应过程不好控制，且产物稳定性不好，导致重复性差。1988年，Morel等人在《Journal of Allergy and Clinical Immunology》发表题为Immunoanalysis of histamine through a novel chemical derivatization的文章，他们用琥珀酰甘氨酰亚胺作衍生试剂，衍生组胺，并制备了针对该衍生物的单克隆抗体，该抗体与衍生物的亲和力比组胺本身高5×10⁵倍，并与其他类似物不存在交叉反应，但是该衍生方法的步骤多，操作复杂，产物纯化难度很大。申请号为201310197597.9的发明专利公开了一种组胺半抗原、人工抗原、抗体及其制备方法与应用，但该制备得到的组胺半抗原所产生的抗体仅针对组胺衍生物（例如苯甲酰化组胺），还不能直接用于检测组胺。