[发明专利]一种环境雌激素无标记免疫传感器的制备方法及应用

权利要求书

1.一种环境雌激素无标记免疫传感器的制备方法，所述环境雌激素无标记免疫传感器包括：工作电极、参比电极和对电极，所述工作电极的基底电极为玻碳电极，其表面依次修饰CoFe₂O₄/rGo、戊二醛、AuPdNRs-Ab、牛血清蛋白（BSA），所述参比电极为饱和甘汞电极，所述对电极为铂丝电极，所述CoFe₂O₄/rGo为铁酸钴/还原石墨烯复合材料，所述AuPtNRs-Ab为金钯核壳纳米棒复合材料孵化的环境雌激素抗体；

其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：

a、制备CoFe₂O₄/rGo；

b、制备AuPdNRs-Ab；

c、制备环境雌激素无标记免疫传感器工作电极；

其中，步骤a制备CoFe₂O₄/rGo的具体步骤如下：

将8~12 mg氧化石墨烯超声分散到25~35 ml无水乙醇中，依次加入0.5~1.5 ml 0.2 mol/mL的 Fe(NO₃)₃水溶液、0.25~0.75 ml of 0.2 mol/L Co(NO₃)₂水溶液和2.0~3.0 ml氨水，80℃下搅拌10~14h，然后转移至高压反应釜中，180℃下反应4~6h；冷却至室温后，离心分离，于50℃真空干燥箱中烘干，即得CoFe₂O₄/rGo；

步骤b制备AuPdNRs-Ab的具体步骤如下：

将20mL金纳米棒溶液和20mL 0.05~0.2 mol/L的十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）溶液混合，在30~45℃下搅拌，并顺序加入3~6 mL 0.1 mol/L的 L-抗坏血酸（AA）溶液、0.5~1 mL 0.03 mol/L的氯化钯（PdCl₂）溶液和 3~6 mL 0.1 mol/L的氢氧化钠（NaOH）溶液，停止搅拌，静置1~3h，离心分离，加入20mL pH7.4的PBS缓冲溶液，然后再加入环境雌激素抗体（Ab），在4℃下震荡24h，得到AuPdNRs-Ab；

步骤c制备环境雌激素无标记免疫传感器工作电极的具体步骤如下：

① 对工作电极进行预处理，使其表面光洁；

② 在①中得到的电极表面滴加5~10 μL 1~5 mg/mL的CoFe₂O₄/rGo水溶液，室温下自然晾干；

③ 在②中得到的电极表面滴加5~10 μL的戊二醛，室温下自然晾干；

④ 在③中得到的电极表面滴加5~8 μL 10 μg/mL的AuPdNRs-Ab溶液，4 ℃ 冰箱中保存晾干，超纯水清洗，晾干成膜，4 ℃保存；

⑤ 在④中得到的电极表面滴加4~6 μL 100 μg/mL的BSA溶液，用以封闭电极上的非特异性活性位点，4 ℃ 冰箱中保存晾干，超纯水清洗，晾干成膜，即得到环境雌激素无标记免疫传感器的工作电极。

2.如权利要求1所述的环境雌激素无标记免疫传感器，用于环境雌激素的检测，步骤如下：

1）将已知浓度的环境雌激素抗原标准溶液加入到40~60 μL、pH=7.0~8.0的PBS缓冲溶液中，制得抗原混合溶液，取5~10 μL抗原混合溶液滴涂到所制备的环境雌激素免疫传感器的工作电极上，在4 ℃ 冰箱中保存晾干，pH=7.0~8.0的PBS缓冲溶液清洗后，晾干，4 ℃保存；

2）将作为参比电极得甘汞电极、作为对电极得铂丝电极，与1）中组装的工作电极组成三电极系统，连接到电化学工作站上；在电解槽中先后加入10~25mL pH=7.0~8.0的PBS缓冲溶液和1mL 3~6 mmol/L的过氧化氢（H₂O₂）溶液；通过计时电流法检测组装的工作电极对H₂O₂的响应；根据所得的电流响应与环境雌激素抗原标准溶液浓度之间的关系，绘制工作曲线；

3）将待测样品溶液代替环境雌激素抗原的标准溶液，按照所述环境雌激素抗原的工作曲线的绘制方法进行检测。

3.如权利要求1和2所述的环境雌激素无标记免疫传感器的制备方法和应用，其特征在于所述环境雌激素选自下列之一：雌二醇、雌三醇、己烯雌酚、双酚A或壬基酚。