[发明专利]甲醛交联/染色质免疫沉淀与分子克隆相结合筛选HSF靶DNA的方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物技术领域，具体而言，涉及筛选转录因子结合的靶DNA的方法。 

背景技术

筛选热激因子(HSF)的靶DNA是研究基因表达的转录调控机理的一个重要领域。目前研究蛋白质与DNA相互作用的常见的方法主要有电泳迁移率变动分析(Electrophoretic Mobility Shift Assay，EMSA)，DNase Ⅰ足迹法(DNase Ⅰ footprinting)，酵母单杂交系统(Yeast One-Hybrid System)等；另外，生物信息学的方法也可以预测DNA上的转录因子结合位点的保守序列。这些筛选特异性位点的方法的应用大大促进了该领域的研究，但它们都存在一定的局限性。首先，每次分离转录调控蛋白结合的靶DNA片段，是依赖蛋白质与靶DNA片段的特异性高亲和力，因此只能得到一些亲和力高的DNA片段，很难富集亲和力弱的靶DNA片段。其次体外蛋白质与DNA的结合不足以充分反映生理条件下DNA与蛋白质相互作用的真实情况，体内可以通过其它因素刺激或抑制结合位点。因为，高等生物的基因组DNA和DNA上的结合蛋白共同组成染色质结构，用以上所提到的方法分析得到的某段DNA与蛋白质的相互作用的结果，在体内则很可能由于染色质高级结构的存在，而使DNA与蛋白质难以接近。因此，在生理状态下，这段DNA很可能并不与其相对应的因子相结合，是没有功能的，反之亦然。另外，染色质结构本身是动态的，DNA与非组蛋白在生理状态下的相互作用通常是瞬时的，以上方法难以捕捉到发生在染色质上的基因表达调控的瞬时事件。与其他方法相比，染色质免疫沉淀技术则可以找出在生理条件下某个DNA结合蛋白与DNA序列的结合位点，从而反映体内基因表达调控的真实情况，因此染色质免疫沉淀技术(chromatin immunoprecipitation assay，ChIP)是一种在体内研究DNA-蛋白质相互作用的理想的方法。采用染色质免疫沉淀技术可以很好地筛选热激因子(HSF)的靶DNA。 

在生理状态下把细胞内的蛋白质和DNA共价交联在一起，超声波将其打碎为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过所要研究的目的蛋白质特异性抗体沉淀此复合体，用Protein-A/G-Agarose/Sepharose特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，用不含Dnase的Rnase和ProteinaseK解除交联，纯化DNA，通过对目的片断的检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。染色质免疫沉淀技术目前是筛选HSF靶DNA的较好方法。 

在蛋白质与靶DNA序列的结合后，靶DNA的分析方法有许多种。如果目的蛋白的靶序列是已知或怀疑某个序列是目的蛋白的靶序列，可以采用狭缝杂交和实时定量或半定量PCR；如果目的蛋白的靶序列未知或者高通量的研究目的蛋白在基因组上的分布情况，找出反式作用因子的结合位点，可以采用Southern杂交、克隆技术和DNA芯片方法。2000年Ren et al成功地开创性结合应用早期用于分析蛋白质-DNA的相互作用的甲醛交联/免疫沉淀技术与基因组芯片杂交技术。Solano et al(2003)则用普通紫外光交联/免疫沉淀，并结合对靶DNA的克隆测序技术，系统性鉴定了果蝇的发育同源蛋白。然而，如何在全基因组范围内筛选拟南芥热激因子HSF1结合的靶DNA是本领域亟待解决的技术难题。 

发明内容

本发明的目的是提供一种筛选HSF靶DNA的方法，为了实现本发明的目的，拟采用如下技术方案： 

1、一种甲醛交联/染色质免疫沉淀与分子克隆相结合筛选HSF靶DNA的方法，其特征在于包括如下步骤： 

步骤一、热激处理拟南芥幼苗； 

步骤二、甲醛处理使HSF与靶DNA共价交联； 

步骤三、染色质免疫沉淀获得HSF的靶DNA； 

步骤四、染色质免疫沉淀DNA经过衔接头介导的PCR扩增后进行分子克隆及测序； 

步骤五、将测序结果在基因组数据库中分析、鉴定靶DNA片段在基因组上的位置。 

在本发明的一个优选实施方式中，其特征在于所述步骤一中，热激处理拟南芥幼苗具体步骤为： 

取南芥幼苗放入培养缓冲液(SIB:0.5mMK₂HPO₄，0.5mMKH₂PO₄,pH6.0和0.1％蔗糖)39℃的水浴中震荡培养30min。 

在本发明的一个优选实施方式中，其特征在于所述步骤二中，甲醛处理使HSF与靶DNA共价交联的具体步骤包括：