[发明专利]用于用动物细胞大量生产源自外源基因的蛋白质的表达载体及其应用

说明书

本发明是2009年12月22日申请的发明名称为“用于用动物细胞大量生产源自外源基因的蛋白质的表达载体及其应用”的第200980157244.8号发明专利申请的分案申请。 

技术领域

本发明涉及能赋予哺乳动物宿主细胞以生产高水平的源自外源基因的蛋白质能力的哺乳动物细胞表达载体。本发明的表达载体尤其适用于生产哺乳动物蛋白质，该蛋白质需要哺乳动物独有的糖基化和折叠，而当通过使用大肠杆菌或酵母菌作为宿主的基因重组来生产时很难具有足够活性。 

背景技术

已经开发了大量用于生产重组蛋白的载体，并且蛋白质的表达水平在使用细菌例如大肠杆菌、真核微生物例如酵母菌和昆虫细胞作为宿主的表达体系里都很高。然而，当表达哺乳动物独有的蛋白质时，可能不会形成常规的三维结构，并且大多数时候会遇到翻译后修饰例如糖基化的问题。因而，需要建立使用哺乳动物细胞作为宿主的表达体系，但是通常来说，大多数情况下表达水平很低。此外，使用重组病毒载体的表达系统也用于动物细胞，其水平高于昆虫细胞，但是从所表达的蛋白质中移除重组病毒载体是一个很麻烦的过程，并且病毒载体自身的危险性也是不可否 认的。 

用哺乳动物细胞作为宿主来生产重组蛋白的实例包括组织纤溶酶原激活因子(专利文件1)、促红细胞生成素(专利文件2和非专利文件1-3)、IFN-γ(非专利文件4)和IFN-β(专利文件3和非专利文件5)。此外，还有很多关于重组生产单克隆抗体的报道(专利文件4-6和非专利文件6-8)。另外，哺乳动物细胞的高表达载体的一个实例是pNOW/CMV-AA(专利文件7)。用该载体生产共凝集素的生产水平在培养4天之后达到11.8μg/mL。但是，这些实例中的重组蛋白的生产水平都还不够。 

本申请的发明涉及的现有技术文件列举如下。 

[现有技术文件] 

[专利文件] 

[专利文件1]日本特开昭59-183693号公报 

[专利文件2]日本特开2002-45191号公报 

[专利文件3]日本特开平07-265084号公报 

[专利文件4]日本特开平07-67648号公报 

[专利文件5]日本特开平06-30788号公报 

[专利文件6]日本特开平06-217786号公报 

[专利文件7]日本特开平10-179169号公报 

[非专利文件] 

[非专利文件1]Fermentation Bioengineering,(1989)4:257页 

[非专利文件2]Proc.Natl.Acad.Sci.USA,(1986)83:6465页 

[非专利文件3]Biotechnology,(1988)6:67页 

[非专利文件4]Proc.Natl.Acad.Sci.USA,(1983)80:4564页 

[非专利文件5]Cytotechnology,(1990)4:173页 

[非专利文件6]Biotechnology,(1992)10:169页 

[非专利文件7]J.Immunol.Methods,(1989)125:191页 

[非专利文件8]Biotechnology,(1992)10:1455页 

发明内容

哺乳动物细胞，尤其是中国仓鼠卵巢细胞(下文中称为CHO细胞)在药物制剂的生产中的应用，已经被证实是安全的并且现在已经成为常规技术。在使用哺乳动物细胞来生产重组蛋白时，提高生产力对降低成本、医疗保健成本控制等等来说都是非常重要的。因此，有需要通过有效基因转移来发展用于生产具有高水平生产能力的转化体的表达载体。 

有效基因转移对哺乳动物细胞内重组蛋白的高水平的简易生产是必需的。有效基因转移是指不管克隆选择容易与否，获得具有高水平生产力的克隆的概率都很高。特别地，其是指活细胞克隆的数量相对于所有转化的细胞在药物选择之后相对较小，从而很容易选择具有高水平生产力的克隆。其也指出现具有高水平生产力的克隆的概率足够高，即使生产目的蛋白质的细胞的数量很小。由于可利用细胞的数量变得很大，需要更多时间和精力用于选择，并导致效率低下，并且有很高可能性会忽略潜在的具有高水平生产能力的克隆。