[发明专利]一种快速检测发酵液中苏氨酸含量的方法

权利要求书

1.一种检测样品中苏氨酸含量的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(i)将样品与第一反应溶液混合均匀，得到第一混合溶液；

(ii)将所述第一混合溶液置于4±1℃放置10-90min后恢复温度至15-30℃；

(iii)将第一混合溶液与第二反应溶液混合均匀得到第二混合溶液；

(iv)检测所述第二混合溶液的OD₃₄₀，每隔1-5分钟检测一次，共检测5-7次；

(v)以检测时间和对应的OD₃₄₀作图，计算斜率即为样品的OD₃₄₀降低速率；

(vi)将计算得到的OD₃₄₀的降低速率与标准曲线进行比较，得到所述样品中苏氨酸含量，

其中，所述第一反应溶液含有HEPES buffer、NADH、PLP、乙醇脱氢酶、DTT和水；

所述第一混合溶液中含有10-500mM HEPES buffer、100μM-1000μM NADH、10μM-100μMPLP、1U-50U乙醇脱氢酶和0.5mM-8mM DTT；

所述第二反应溶液中含有1-20U LTA，余量为水。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(i)中将样品稀释后与所述第一反应溶液混合均匀，稀释后的样品中苏氨酸的浓度为0.1-10mM。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，稀释后的样品与第一反应溶液的体积比为1:1-5。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一混合溶液与所述第二反应溶液的体积比为1-5:1。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，通过以下步骤获得所述标准曲线：

(a)将浓度范围为0.1mM～8mM的数个浓度不同的标准苏氨酸溶液分别与第一反应溶液混合均匀，得到第一混合溶液；

(b)将所述第一混合溶液置于4±1℃放置10-90min后恢复温度至15-30℃；

(c)将第一混合溶液与第二反应溶液混合均匀得到第二混合溶液；

(d)检测所述第二混合溶液的OD₃₄₀，每隔1-5分钟检测一次，共检测5-7次；

(e)以测定时间和对应的OD₃₄₀为坐标作图，计算斜率为OD₃₄₀降低速率；

(f)以标准苏氨酸溶液的浓度及对应的OD₃₄₀降低速率为坐标，绘制得到所述标准曲线，

其中，步骤(a)中所述第一反应溶液含有HEPES buffer、NADH、PLP、乙醇脱氢酶、DTT和水；

步骤(a)得到的所述第一混合溶液中含有10-500mM HEPES buffer、100μM-1000μMNADH、10μM-100μM PLP、1U-50U乙醇脱氢酶和0.5mM-8mM DTT；

所述第二反应溶液中含有1-20U LTA，余量为水。

6.如权利要求1或5所述的方法，其特征在于，所述第一混合溶液中含有50-400mMHEPES buffer、100μM～800μM NADH、20μM～80μM PLP、1U～35U乙醇脱氢酶和0.5mM～5mMDTT。

7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤a)中标准苏氨酸溶液与第一反应溶液的体积比为1:1-5；和/或

所述步骤c)中所述第一混合溶液与第二反应溶液的体积比为1-5:1。

8.如权利要求1或5所述的方法，其特征在于，所述检测样品中苏氨酸含量与所述标准曲线的建立同时进行。

9.如权利要求1或5所述的方法，其特征在于，所述LTA来源于铜绿假单胞菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母、假丝酵母、念珠菌中的一种或两种以上。

10.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(a)配制8个浓度不同的标准苏氨酸溶液，浓度分别为0.2mM、0.5mM、1mM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM。