[发明专利]弗尼斯弧菌检测用引物对、试剂盒及检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及食源性病原菌的快速检测方法，尤其涉及利用PCR技术检测样品中弗尼斯弧菌的方法。还涉及检测所使用的特异性引物序列和检测试剂盒。

背景技术

弧菌作为近海河口环境中微生物区系的成员，广泛分布于自然水域及渔业生物中，是引发人类细菌性疾病的主要病原菌之一。人们通过饮用不清洁水、食用未加工或未加工熟的带有致病性弧菌的食物，特别是海产品容易感染发病。弧菌属中霍乱弧菌(Vibri.cholerae)、副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、创伤弧菌(Vibrio vulcificus)、河弧菌(Vibrio fluvialis)、拟态弧菌(Vibrio minicus)、麦氏弧菌(Vibrio metschnikovii)、霍利斯弧菌(Vibrio hollisae)、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、弗尼斯弧菌(Vibrio furnissii)、海鱼弧菌(Vibrio damsela)、辛辛那提弧菌(Vibrio cincinatiensis)和鲨鱼弧菌(Vibrio carchariae)12个种为人潜在肠道致病菌。由弗尼斯弧菌引起的急性胃肠炎首先发现于日本及东方一些国家，其后扩散至西方国家，通常呈爆发流行或散发性急性胃肠炎。弗尼斯弧菌能产生肠毒素，为旅游者腹泻的病原菌之一，临床上以腹泻及腹痛为主，并伴随有恶心及呕吐等症状，也有严重致死病例报。

快速、准确的检测食品中致病菌是有效预防和控制病原菌感染的重要保障，但是目前国内外现有的检测方法中，对弗尼斯弧菌的检测只有常规的病原菌分离培养法，该方法不仅费时费力，无法满足快速高通量检测病原菌的要求；再加上弧菌属细菌生化反应相对不稳定，给鉴定工作带来了很多困难和不确定性，容易出现假阴性和假阳性结果，影响检测结果质量，并且会带来较大的经济损失。随着分子生物学技术的发展，人们采用PCR技术应用于细菌的快速诊断，该方法不仅敏感、准确，而且快速、高通量，通过DNA提取、PCR扩增、电泳观察等分子生物学手段检测病原菌的方法，但现有技术中还未见有针对弗尼斯弧菌检测的PCR技术。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可快速、准确、灵敏地检测食品和水产品样品中弗尼斯弧菌的PCR检测方法。

为实现上述目的，本发明首先提供一种弗尼斯弧菌检测用引物对，其碱基序列为SEQ ID NO.1/2。

正向引物(SEQ ID NO.1)：5′-CAATCCAAGATGGTCACGCTAA-3′，

反向引物(SEQ ID NO.2)：5′-TTTATCCACCGCGTACAGCTT-3′。

另一方面，本发明提供一种弗尼斯弧菌检测用试剂盒，所述试剂盒是PCR检测试剂盒，其中包括碱基序列为SEQ ID NO.1/2的引物对。

作为优选，该试剂盒中还包括用于PCR检测的阳性对照模板，所述阳性对照模板为浓度为10nmol/L～100nmol/L的弗尼斯弧菌标准菌株的DNA提取物。所述试剂盒在检测应用中，可以使用其它任意非弗尼斯弧菌DNA提取物为阴性对照模板，并使用双蒸水为空白对照。

本发明的再一目的在于提供一种弗尼斯弧菌的检测方法，所述方法为PCR检测方法，其包括以SEQ ID NO.1/2为引物对进行PCR扩增的步骤。

上述本发明的弗尼斯弧菌的检测方法的检测对象是食品和水产品样品，目的在于检查待测样品中是否存在弗尼斯弧菌。该方法中，PCR扩增以弗尼斯弧菌ToxS基因(GenBank登陆号CP002377.1)的112～261位的核酸序列为靶基因，以SEQ ID NO.1/2所示的引物对，通过PCR选择性扩增所述靶基因，并检测确认是否存在有扩增产物。

更为具体地，上述本发明的的的弗尼斯弧菌检测方法，包括如下步骤：

⑴提取待测样品DNA，得到模板液；

⑵PCR扩增：

反应体系：模板液2μl、10×PCR缓冲液2μL、dNTP0.4μL、Taq酶1U、浓度为10μM的引物对SEQ ID NO.1/2各0.5μL、补充灭菌双蒸水至总体积为20μL；以上各组分加入至0.2mL PCR反应管中，混匀，5000r/min离心10s；

反应条件：94℃预变性4min，然后94℃1min、59℃1min、72℃1min，35个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存；

⑶PCR扩增产物电泳检测：