[发明专利]一种酶溶性高纯超螺旋结构Ⅰ型胶原蛋白的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及到一种具有三螺旋结构的酶溶性高纯Ⅰ型胶原蛋白的制备工艺，同时也是一种低抗原性高纯Ⅰ型胶原蛋白的制备工艺，属于生物提取技术领域。 

背景技术

胶原蛋白是动物支持结构中最主要也是最重要的一类蛋白质，在人体的皮肤、血管、骨骼、软骨以及结缔组织中广泛分布。它具有特殊的三螺旋结构，也称为超螺旋结构，即由三条左手螺旋α链通过右手螺旋的方式互相缠绕而成。同时，胶原蛋白的甘氨酸含量几乎占了1/3，脯氨酸和羟脯氨酸的含量为各种蛋白质中含量最高，胶原蛋白还拥有其它蛋白质不存在的羟基赖氨酸。胶原蛋白特有的空间结构和化学组成，使其具备很强的生物活性和独特的生物功能，在食品、保健品、化妆品、生物医药等众多领域中都有十分广泛的应用。 

特别是在高端的生物医药领域，高纯超螺旋结构胶原蛋白是细胞外基质(EMC)的主要化合物，具有其他材料所不具备的低毒性、低免疫抗原性、高生物相容性、可生物降解性等优势，它能参与细胞的迁移、分化和增殖，并使骨、腱、软骨和皮肤具有一定的机械强度，可作为生物材料，具有巨大的市场价值。据统计，全球市场每年要销售超过40亿美元的以胶原蛋白为原料的生物医用材料。 

由于从不同组织中分离纯化得到的胶原蛋白在肽链、氨基酸组成、理化性质和胶原蛋白构型方面有显著的差异，因此本发明选择生物体内含量最为丰富和市场潜力最为巨大的Ⅰ型胶原蛋白作为目标产品，同时，针对近年来由于疯牛病、口蹄疫等疾病在全球范围内肆虐，而导致人们逐渐对原来以猪、牛等陆生哺乳动物的皮、腱等为原料提取的胶原蛋白的安全性产生置疑的不利趋势，以及由于特定宗教原因，在信仰伊斯兰教地区的人民对源自牲畜的胶原蛋白存在固有排斥的不利情况，本发明挑选主要含有Ⅰ型胶原蛋白的鱼鳞作为制备原料。 

生物制品的抗原性将大大限制其在食品、化妆品、药品等领域的应用。相关文献显示以鱼鳞或鱼皮为原料制备胶原蛋白，如果采取酸溶提取或因处理不当而导致胶原蛋白变性成为明胶，均有可能使制品的抗原性增大。而酶溶提取可以去除胶原蛋白的主要抗原决定基团——位于非螺旋部分的端肽，这样既可以保持胶原蛋白的三螺旋结构，又可以有效降低胶原蛋白制品的抗原性，保证胶原蛋白在食品、保健品、化妆品、生物医药领域的广泛应用。正因如此，它被大量中外文献推崇使用。 

目前，现有技术中胶原蛋白的提取分离工艺基本都是先将原料经过氢氧化钠脱除杂蛋白，再在低温条件下，采用单纯的醋酸溶剂或一定量的胃蛋白酶配合醋酸溶剂长时间浸泡提取粗酸溶性胶原蛋白或粗酶溶性胶原蛋白，在此基础上，加入大量的盐(氯化钠或是硫酸铵)进行盐析沉淀，或是调解pH至中碱性条件凝絮成蛋白质凝胶，再将蛋白沉淀或凝胶用酸溶解，然后装入透析袋中，使用蒸馏水或0.02M磷酸氢二钠进行长时间的反复透析，透析后得到的胶原蛋白液体通过冷冻干燥得到最终的酸溶性胶原蛋白或酶溶性胶原蛋白。这些制备工艺的缺陷在于：工艺设计没有关注酸溶和酶溶两种提取方法对胶原蛋白产品抗原性的影响，流程繁琐复杂，分离纯化周期冗长，制备成本高，工艺很难放大并实施规模化生产；而且制备的酶溶性胶原蛋白构型不明确，三螺旋结构是否完整不清楚，分子量的数值不确切，产品的纯度有限——最多只能达到SDS-PAGE电泳级别，产品的得率也不高。 

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种工艺更为简便，成本更为低廉，周期更为紧凑，后续放大规模化生产更为容易，同时保证产品的纯度、得率、低抗原性和特有的三螺旋结构的酶溶性高纯Ⅰ型胶原蛋白的制备工艺，为大宗鱼类水产下脚料——鱼鳞突破制约高值开发的技术瓶颈，在食品、保健品、化妆品和药品，特别在高端生物材料领域的高值开发利用开拓新的途径。 

本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。本发明是一种酶溶性高纯超螺旋结构Ⅰ型胶原蛋白的制备工艺，所述的“高纯”为色谱纯度90％以上， 方法包括以下步骤： 

(1)原料预处理 

将鱼鳞投入反应釜中，加入鱼鳞重量2～10倍的碱溶液，搅拌1～12小时，除掉鱼鳞的脂肪和杂蛋白等杂质，用水洗净，加入鱼鳞重量2～10倍的酸溶液，搅拌1～12小时，再用水洗净，其中碱溶液的质量体积浓度为1～4％，酸溶液的质量体积浓度为3～8％，预处理温度控制在0～25℃之间； 

(2)Ⅰ型胶原蛋白提取