[发明专利]快速检测花生抗旱性的方法及所使用的探针

说明书

技术领域

本发明涉及一种抗旱性检测方法，尤其涉及一种快速检测抗旱性的方法及所使用的探针，特别涉及对花生品种的抗旱性检测。

背景技术

花生是一种重要的油料作物，在我国山东、湖南、广东各地均普遍种植。干旱是影响花生产量的最主要因素之一，所以如何快速准确的分辨不同花生品种抗旱性的强弱，对于筛选优良品种，提高花生产量具有重要意义。

传统鉴定花生抗旱性的方法主要是通过多种抗旱生理指标，如脱落酸(ABA)含量、游离脯氨酸含量、叶片含水量、干旱情况下叶片萎蔫指数等，运用隶属函数法，综合考虑诸多生理指标情况，进行综合排名，以确定不同品种花生抗旱性的差异，但传统方法鉴定花生抗旱性所需材料较多、耗时久、操作繁琐，重复性差、结果难以量化。

ABA作为植物干旱胁迫下的应答激素，干旱胁迫下，可以通过调节相关抗旱基因表达，激活植物应对干旱系统，抵御干旱胁迫，其合成酶9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶(NCED)在合成过程中起关键作用。花生中的NCED基因命名为AhNCED1。早期研究发现，不同花生品种的抗旱性与其体内ABA水平呈正相关，即在水分胁迫下抗旱性强的花生品种累积的水平高于不抗旱品种；AhNCED1的基因及其蛋白在正常生长条件与干旱胁迫下的表达水平与花生体内的ABA含量呈现正相关性，直接影响不同花生抗旱性。

发明内容

本发明的目的是，根据上述花生体内ABA含量与AhNCED1基因和蛋白表达的正相关性，针对传统鉴定花生抗旱性方法的缺点，设计了一种基于分子生物学的鉴定花生抗旱性方法。

为达到以上技术目的，本发明采用的技术方案如下：

首先，设计一种花生9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶(AhNCED1基因)的探针，所述探针的5’端到3’端的脱氧核苷酸序列为：ATGTCCCCGGAATCTCCATCCTCTCTGT。

然后，设计一种快速检测花生抗旱性的方法，其中，采用如前所述的花生9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶的探针检测花生的组织中的9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶的基因的相对表达量，根据所述9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶的基因的相对表达量的高低，判定被检测的花生品种的抗旱性的强弱情况。

关于检测材料：所述花生组织是花生叶片。具体地，所述花生叶片为花生四叶期幼苗的叶片。

检测材料需要进行前期处理：所述花生叶片在对花生植株进行干旱胁迫处理后进行9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶的基因的相对表达量检测。所述干旱胁迫处理时间为2小时。所述花生植株用20％的平均分子量为6000的聚乙二醇(PEG-6000)进行干旱胁迫处理。

基因表达的检测：所述花生9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶的基因的相对表达量的检测方法为实时定量荧光聚合酶链式反应(Real Time PCR)。

具体地，所述实时定量荧光聚合酶链式反应的反应体系包括目的基因的探针和引物对，以及内参基因的探针和引物对；

所述目的基因为所述9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶基因，其引物对的5’端到3’端的脱氧核苷酸序列分别为，上游：TTACCTGTGGGATTGTTTGC，下游：ACATGAGCCTCTACTTCTGC；

所述内参基因为18S，其引物对的5’端到3’端的脱氧核苷酸序列分别为，上游：TACGTCCCTGCCCTTTGTAC，下游：CCTACGGAAACCTTGTTACGAC；所述18S的探针的5’端到3’端的脱氧核苷酸序列为：ACACACCGCCCGTCGCTCCTACCGATTGAA。

更进一步地，所述实时定量荧光聚合酶链式反应的反应条件为：首先在95℃下保温30秒；然后在如下条件循环40次：95℃保温5秒，降温至60℃保温34秒。

关于相对表达量的统计方法：所述花生9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶的基因的相对表达量采用2^-ΔΔC_T法进行统计。

基于上述的基因表达的检测方法和数据统计方法，判定被检测的花生品种的抗旱性的标准为：所述花生9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶的基因的相对表达量大于500的定义为强抗旱花生品种；所述花生9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶的基因的相对表达量为50～500的定义为中等抗旱花生品种；所述花生9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶的基因的相对表达量小于50的定义为弱抗旱花生品种。

进一步地，所述花生9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶的基因的相对表达量越高，指示被检测的花生品种的抗旱性越强。