[发明专利]细菌16SrDNA500片段基因测序及dblast数据库分析方法

权利要求书

1.一种细菌16SrDNA500片段基因测序及dblast数据库分析方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1：细菌DNA样本提取，

步骤2：细菌16S rDNA500片段基因扩增，

步骤3：纯化PCR产物，

步骤4：循环测序反应，

步骤5：纯化测序反应产物，

步骤6：制备毛细管电泳样品并电泳，和

7.1基因测试质量分析接受标准。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1中，提取试剂盒为Ultra Sample Preparation Reagent，进一步包括以下步骤：

1.1预加热：打开恒温混匀仪，设置温度为99℃；

1.2在试管上标记样品名称，向每个试管中各加入PrepMan Ultra样品制备试剂100μl；

1.3从长有菌落的琼脂培养基上挑取单一克隆到上一步加入的样品制备试剂中，制成悬液；

1.4每个试管充分混悬振荡10到30秒；

1.5样品置99℃加热10分钟，然后冷却到室温；

1.6样品置微型离心管中，以12000rpm的转速离心2分钟；

1.7立即转移上层液50μl到新的已标记的微型离心管中；

1.8吸取无核酸酶水495μl到微型离心管；

1.9从第7步所制备溶液转移5μl到495μl的水中，获得1:100的DNA样品溶液；

1.10涡旋离心管，以混合溶液，1:100的溶液可保存于4℃，期限为1个月，或-20℃，期限为一年。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤2中，16S rDNA500基因扩增试剂盒：ABFast50016S rDNA PCRKit，进一步包括以下步骤：

2.1将试剂盒中的三管试剂置室温下解冻；

2.2试剂使用前温和地混悬5秒，分别吸取15μl的PCR Master Mix试剂到96孔快速PCR板或PCR管上；需加试剂的孔数量或管数为所有样品数量加上阳性和阴性对照的总数

2.3取步骤一制得的1:100的样品DNA15μl，转移到样品孔或管中；

2.4吸取15μl的阳性和阴性对照至相对应的孔或管中；

2.5将粘膜覆盖在96孔板上并封严，或盖紧管盖；

2.6打开PCR仪，按试剂盒指导设置PCR仪的热循环参数；

热循环参数：初始阶段：95℃维持10秒钟；

循环阶段：95℃融解变性0秒；64℃退火15秒；

循环数30个；

最终扩增阶段：72℃维持1分钟；

结束阶段：降至4℃保温；

设置反应体积为30μl；

2.7放置96孔板或管到PCR仪，并运行PCR程序；

完成后，PCR产物可存储于-15～-25℃，需要时取用，PCR产物在-20℃可保持稳定状态至少6个月而不降解。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤3中，PCR产物纯化试剂盒：AxyPrep PCR清洁试剂盒，进一步包括以下步骤：

3.1使用前，取Buffer W2concentrate浓缩物，按试剂瓶上指定的体积加入无水乙醇，使用前注意检查Buffer PCR-A是否出现沉淀，如有沉淀，用65℃温浴加热至沉淀完全溶解并冷却至室温后使用；

3.2向步骤二获得的PCR产物中，加入3倍体积的Buffer PCR-A(若不足100μl，补足至100μl)，混匀后转移至DNA制备管，将DNA制备管置于2ml离心管(试剂盒提供)中，以12000g离心1分钟，弃滤液；

3.3将制备管放回2ml离心管中，加700μl的Buffer W2，以12000g离心1分钟，弃滤液；

3.4将制备管放回2ml离心管中，加400μl的Buffer W2，以12000g离心1分钟，弃滤液；

3.5将制备管置于洁净的1.5ml离心管(试剂盒提供)中，在制备管的膜中央加25～30μl的Eluent或去离子水，室温静置1分钟，以12000g离心1分钟洗脱收集DNA。