[发明专利]一种利用四倍体植株与二倍体植株杂交育种法培育三倍体霍山石斛的方法

说明书

技术领域

本发明涉及兰科石斛属药用植物生物育种方法，特别涉及一种利用四倍体植株与二倍体植株杂交育种法培育三倍体霍山石斛的方法。

背景技术

霍山石斛(学名：Dendrobium huoshanense C．Z．Tang  et S．J．Cheng)在国际上有“药界大熊猫”之称的野生霍山石斛，史称霍石斛，俗称米斛，距今已有200多年的历史。原产于我国安徽大别山等地，是国家现代中药重大专项200多个濒危稀缺品种中首位保护品种。是药用石斛中的极品，也是霍山县独有的、拥有原产地地理标志的名贵中药材，历史上被誉为“中华九大仙草之首”、 “健康软黄金”。《神农本草》、《本草纲目》均有记载。霍山石斛所含有的多糖、生物碱类物质有清咽利嗓，保肝明目、降糖降脂、延年益寿之功效。本品能大幅度提高人体内SOD(延缓衰老的主要物质)，在增强免疫力、抗疲劳、延缓衰老和促进癌细胞凋亡等方面有明显作用，从而达到保健保健的功效。

多倍体育种是植物新品种培育的重要手段，多倍体育种起源于20 世纪初，现在已广泛应用于植物新品种的培育中。多倍体由于基因组倍性的增加，往往表现出形态上的巨大性和抗性增强等特点。其中三倍体还具有不育特点，即可作为永久杂种，也有利于商业保护。

通过基因组三倍化，可以获得具有多倍体和杂交种双重优势的三倍体，其优势表现出具有巨大性和不可替代性，可以提高霍山石斛药材产量、品质和抗逆性。三倍体霍山石斛则具有产量和质量上的双重优势。

国家“十一五”和“十二五”计划均提出“种质资源的挖掘、保存、创新和新品种的定向培育”的任务。为贯彻、落实这项任务，我们倡导应用“基因组多倍化与融合杂交相结合”的方法，实现种质资源的创新和新品种的定向培育的目的。目前仅有三倍体铁皮石斛和春石斛兰的培育方法已公开并授权，迄今为止，三倍体霍山石斛(染色体核型指数为2n=3x=57)及培育方法还未见有公开报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种利用四倍体植株与二倍体植株杂交育种法培育三倍体霍山石斛的方法，该方法培育出的三倍体霍山石斛与二倍体霍山石斛相比，其主要形态性状基本相同，但其茎、叶、花表现出明显的增大，产量与多糖含量显著提高，抗逆性增强。本发明产生的三倍体霍山石斛具有多倍体和杂交种的双重优势。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

    一种利用四倍体植株与二倍体植株杂交育种法培育三倍体霍山石斛的方法，包括以下步骤：

    (1)优选出抗逆性好、生长快、茎秆粗、茎高长、分蘖多、纤维含量低、药效成分含量高的不同产地的霍山石斛品种作为多倍体培育的源植株亲本；

    (2)对不同品种原植株种子在固体培养基中进行无菌播种，获得2倍体原球茎；

    (3)制备不同品种2倍体原球茎的原生质体，进行细胞原生质体融合，并培养成愈伤组织；

    (4)对检测出的四倍体愈伤组织进行诱导分化，获得四倍体植株幼苗；

    (5)对四倍体植株幼苗进行常规炼苗驯化和栽培至开花；

    (6)把四倍体植株与二倍体植株人工授粉杂交，结实，即得三倍体霍山石斛种子；

    (7)对三倍体种子无菌播种、培养，获得大量三倍体幼苗。

步骤(1)中所述霍山石斛为分布在大别山山系的不同产地具有优良性状的品种，其中高纬度、高海拔地区的品种具有抗逆性强、茎秆粗、药效成分含量高的特点，低纬度、低海拔地区的品种具有生长速度快、茎高长、分蘖多、纤维含量低的特点。

步骤(2)中所述培养为固体培养基培养，适合脱分化形成愈伤组织的培养基均可。优选大量元素减半的1/2MS培养基，调整蔗糖浓度为5%-8%，优选添加10-15%的椰乳，2,4-D 0.2-2.0 mg/L, NAA 0.2-2.0 mg/L；培养温度在25-18℃的昼夜温差范围内，光照时间10-12小时，光照强度2000-3000Lux，色温在4500-5500k。

步骤(3)中所述原生质体的制备方法优选酶解法制备，细胞融合办法优选电击融合法。

步骤(4)中所述四倍体为异源双二倍体或同源双二倍体；其中异源双二倍体具有杂交优势，因为这是由不同品种的个体细胞间的融合而成，这不同于利用秋水仙素及其功能类似物通过抑制细胞有丝分裂的方法制备的四倍体，这种办法制备的四倍体仅仅是同源双二倍体；所述检测染色体倍数为常规染色镜检办法，选取染色体数目2n=4x=76的幼苗，是培育成功的四倍体。