[发明专利]一种壳聚糖磁性纳米粒子固定普鲁兰酶的方法

权利要求书

1.一种采用壳聚糖磁性纳米粒子固定普鲁兰酶的方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）壳聚糖磁性纳米粒子的制备；

（2）磁性纳米粒子表面氨基化处理；

（3）氨基化处理后的磁性纳米粒子与普鲁兰酶在交联剂的存在下形成共价键，普鲁兰酶被固定。

2.根据权利要求1所述的固定普鲁兰酶的方法，其特征在于具体步骤为：

（1）壳聚糖磁性纳米粒子的制备方法：

将壳聚糖粉末加入到乙酸溶液中，配制成质量百分比浓度为3~5%均一的淡黄色壳聚糖溶液；将浓度为25%的戊二醛溶液缓慢加入到上述壳聚糖溶液中，继续匀速搅拌15~30min，再静置12~24h，得到壳聚糖水凝胶；将水凝胶依次浸泡在0.05~0.2mol/L Fe³⁺的水溶液、水、0.02~0.1mol/L Fe²⁺的水溶液中，循环四次；然后将含有铁离子的壳聚糖水凝胶浸泡在1~1.5 mol/L的NaOH 溶液中碱化处理12~24h，得到黑色的水凝胶，将此水凝胶采用乙酸及过氧化氢溶液水解即得到黑色的具有磁响应的纳米粒子，在外加磁场下收集磁响应物质，然后用蒸馏水漂洗至中性；所得到的磁性纳米粒子分散性良好，直径在5~12nm左右；

（2）磁性纳米粒子表面氨基化处理的方法：

称取已制备好的壳聚糖磁性纳米粒子，于甲醇或甲苯溶液中超声分散0.5~1.5 h，然后再将溶液调为碱性，在机械搅拌下缓慢加入硅烷偶联剂，50℃下搅拌反应4~8h；反应后的产物用磁场收集，分别用无水乙醇和去离子水洗涤数次，洗涤过的固体在室温下干燥，得到氨基化的壳聚糖磁性纳米粒子；

（3）氨基化处理后的磁性纳米粒子固定普鲁兰酶的方法：

将干燥的氨基化的壳聚糖磁性纳米粒子超声分散在磷酸缓冲液中，振荡3~5小时，经磁场分离，然后再分散到磷酸缓冲溶液中，于室温搅拌反应条件下缓慢加入交联剂溶液，搅拌反应1~15h，再在外加磁场下收集磁性纳米粒子，并用去离子水多次洗涤以除去残留的交联剂；处理好的载体按1:2~1:4（mg:ml）的比例加入到普鲁兰酶溶液中，于25~40℃水浴振荡器中，振荡固定12~36h；所述普鲁兰酶溶液的浓度为15~50μg/mL，pH值为3.5~5.4。

3.根据权利要求2所述的固定普鲁兰酶的方法，其特征在于步骤（1）中所述戊二醛溶液的用量为每100ml乙酸溶液中加入0.2~1ml。

4.根据权利要求2所述的固定普鲁兰酶的方法，其特征在于步骤（2）中所述硅烷偶联剂为3-氨基丙基三乙氧基硅烷或3-(2-氨基乙基氨基)丙基甲基二甲氧基硅烷。

5.根据权利要求2所述的固定普鲁兰酶的方法，其特征在于步骤（2）中所述已制备好的壳聚糖磁性纳米粒子与硅烷偶联剂的比例为1g:1ml~1g:8ml。

6.根据权利要求2所述的固定普鲁兰酶的方法，其特征在于步骤（2）、（3）中，使用NaOH、KOH、NaHCO₃或氨水将溶液调为碱性。

7.根据权利要求1或2所述的固定普鲁兰酶的方法，其特征在于步骤（3）中所述普鲁兰酶的浓度为50μg/mL。

8.根据权利要求1或2所述的的固定普鲁兰酶的方法，其特征在于步骤（3）中所述交联剂为戊二醛、碳二亚胺或环氧氯丙烷中的至少一种；加入交联剂后溶液中戊二醛的浓度为0.5~15%，碳二亚胺的浓度为10~200mM，环氧氯丙烷的浓度为5~15%。

9.根据权利要求1或2所述的固定普鲁兰酶的方法，其特征在于步骤（3）中使用戊二醛和/或碳二亚胺做交联剂时，加入硼氢化钠或氰基硼氢化钠后再震荡反应1h。

10.按照权利要求9所述的的固定普鲁兰酶的方法，其特征在于使用戊二醛和/或碳二亚胺做交联剂时，加入硼氢化钠或氰基硼氢化钠，将酶与载体形成的亚胺还原为更为稳定的伯胺；加入的硼氢化钠或氰基硼氢化钠与普鲁兰酶液的比例为0.5:1~3:1 (mg:ml)。