[发明专利]一种人脐带华通氏胶组织的冻存保护液及其制备与应用

权利要求书

1.一种人脐带华通氏胶组织的冻存保存液，其特征在于，包括如下体积百分比的组分：渗透性冷冻保护剂5~10%、非渗透性冷冻保护剂1~5%、血清替代品10~20%和无血清基础培养基70~80%。

2.根据权利要求1所述的人脐带华通氏胶组织的冷冻保存液，其特征在于，包括如下体积百分比的组分：渗透性冷冻保护剂10%、非渗透性冷冻保护剂5%、血清替代品10%和无血清基础培养基75%。

3.根据权利要求1或者2所述的人脐带华通氏胶组织的冷冻保存液，其特征在于，所述渗透性冷冻保护剂为二甲基亚砜或者甘油。

4.根据权利要求3所述的人脐带华通氏胶组织的冷冻保存液，其特征在于，所述非渗透性冷冻保护剂为羟乙基淀粉或者人血白蛋白。

5.根据权利要求4所述的人脐带华通氏胶组织的冷冻保存液，其特征在于，所述血清替代品为FetalClone III或者Ultroser G。

6.根据权利要求5所述的人脐带华通氏胶组织的冷冻保存液，其特征在于，所述无血清基础培养基为DMEM/F12或者RPMI1640。

7.根据权利要求6所述的人脐带华通氏胶组织的冻存保护液，其特征在于，包括如下体积百分比的组分：二甲基亚砜10%，人血白蛋白5%，FetalClone III 10%和DMEM/F12 75%。

8.一种权利要求1~7任一项所述的人脐带华通氏胶组织的冻存保护液的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

　　　1）将无血清基础培养基、非渗透性冷冻保护剂和血清替代品置于2-6℃下预冷，然后将其混合、摇匀；

　　　2）向步骤1）得到的混合物中加入渗透性冷冻保护剂，摇匀；

　　　3）将步骤2）所得混合物置于2~6℃温度条件下冷藏30min以上，即得人脐带华通氏胶组织冻存保护液。

9.一种人脐带华通氏胶组织的冻存方法，其特征在于，包括如下步骤：

　　　1）脐带预处理：在二级生物安全柜中，用医用酒精对脐带组织表面消毒，然后剪去脐带结扎两端，并用无菌PBS清洗3~5次，以去除脐带表面和血管内的血液及凝块；

　　　2）剥取华通氏胶组织：将步骤1）处理后的脐带剪为1~3cm长的小段，再用无菌PBS溶液洗去残余血液与凝块，再剥离脐动脉组织和脐静脉组织；然后剥取华通氏胶组织，在将得到的华通氏胶组织剪为1~2mm²的小块；

　　　3）人脐带华通氏胶组织冻存：取权利要求1~7任一项所述人脐带华通氏胶组织冻存保护液，备用；然后将步骤2）得到的华通氏胶组织重悬于所述人脐带华通氏胶组织冻存保护液中，再将其置于2~6℃下预冷20~30min，然后进行程序降温处理即可；

　　　所述程序降温处理的具体操作为：首先，置于4℃下冷藏10min；然后以1~1.5℃/min的速率降温至-40℃，再以10℃/min的速率降温至-90℃， 最后迅速转移至液氮-190℃环境储藏即可。

10.根据权利要求9所述的人脐带华通氏胶组织的冻存方法，其特征在于，步骤3）中人脐带华通氏胶组织的冻存保护液的体积和人脐带华通氏胶组织的质量的比例为2ml:1g.。