[发明专利]尖嘴魟微卫星位点、引物及其用途

说明书

技术领域

本发明涉及，尤其涉及的是一种尖嘴魟微卫星位点序列、引物及其用途。

背景技术

尖嘴魟(Dasyatis zugei)隶属鲼形目、魟科，是一种生活在近海区域的软骨鱼。受到污染、过度捕捞、渔业养殖等影响，目前种群数量日益减少，亟待保护。对其保护需要了解其种群结构及遗传背景等遗传学信息，目前国内尚没有开展软骨鱼的分子遗传学研究。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，首次提供尖嘴魟的微卫星位点及引物，也是目前国内首次针对软骨鱼类的分子遗传学研究结果。

本发明的技术方案如下：

尖嘴魟微卫星位点，包括10个稳定的多态性微卫星位点，其序列分别如SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：10所示。

所述的尖嘴魟微卫星位点的引物，其序列分别如SEQ ID NO：11-SEQ ID NO：30所示。

所述的尖嘴魟微卫星位点或者所述的引物的用途，包括分子生态学研究，谱系分析，种质资源调查，辅助育种和个体识别，所述10个稳定的多态性微卫星位点组合使用，或者其对应的引物组合使用。

所述10对引物在15个尖嘴魟个体中的基因分型结果显示，等位基因数为3-24个，平均等位基因数为13.6个。期望杂合度He为0.5-0.984，观测杂合度Ho为0.429-1，表明这10对引物多态性高，可以满足尖嘴魟的个体识别。

附图说明

图1尖嘴魟DNA 1％琼脂糖-EB凝胶电泳结果；M：Trans2K DNA Marker；1-4：尖嘴魟全基因组DNA；Y：空白对照；

图2 AFLP扩增产物1％琼脂糖-EB凝胶电泳结果；M：Trans2K DNA Marker；1-8：AFLP扩增产物；Y：空白对照；

图3菌落PCR 2％琼脂糖-EB凝胶电泳结果；M：Trans2K DNA Marker(同图2)；1-8：菌落PCR结果，其中2、6、7和8号为双带，被认为阳性重组子；Y：空白对照；

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。

1、DNA抽提

利用尖嘴魟肌肉组织，提取基因组DNA。抽提方法采用SDS/蛋白酶K裂解、酚-氯仿抽提途径(Sambrook et al.，1999)。DNA抽提效果见图1(展示部分).

2、尖嘴魟微卫星富集文库的构建

取基因组DNA 250ng左右，使用限制性内切酶MseI打断，同时与MseI的AFLP受体接头(5'-TAC TCA GGA CTC AT-3’/5’-GAC GAT GAG TCC TGA G-3’)进行连接。将消化产物稀释十倍以后，使用AFLP受体特异的引物(5'-GAT GAG TCC TGA GTA AN-3’，简称MseI-N)进行PCR扩增。扩增产物使用1％琼脂糖-EB凝胶检测，结果为大于200bp的弥散带，见图2。

分别使用带有生物素接头的探针(AC)₁₂和(AG)₁₂与上述PCR扩增片段进行杂交后，使用链霉亲和素磁珠进行吸附洗脱，以获得所需的单链微卫星重复序列。以捕获的DNA为模板，以MseI-N为引物进行双链DNA恢复。PCR产物经PCR清洁试剂盒(Axygen)纯化，并用1％琼脂糖-EB凝胶检测，结果为大于200bp的弥散带则视为成功。

将纯化后的双链恢复产物与pEASY-T1 Simple Cloning Vector(TransGen Biotech)连接后转化于Trans5 α chemically competent cells(TransGen Biotech)中。将已转化的感受态细胞涂布于添加0.5mM IPTG和0.5μg/mL X-Gal含0.06mg/ml氨苄(Amp)的LB固体培养基平板上，在恒温培养箱中37℃培养13h，得到包含AC、AG两种重复的微卫星文库。

3、阳性克隆的筛选、测序及引物设计