[发明专利]陈氏新银鱼微卫星位点、引物及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及的是陈氏新银鱼微卫星位点、引物及其应用。

背景技术

陈氏新银鱼(Neosalanx tangkahkeii)属于胡瓜鱼目新银鱼属，又称为太湖新银鱼、近太湖新银鱼，它是中国的特有物种，分布于长江中下游，包括其支流和附属湖泊。陈氏新银鱼是我国的传统经济鱼类，尤其是淡水鱼类这一块。但是，由于水体污染、过度捕捞，以及生境改变等原因，导致陈氏新银鱼的数量大大减少，所以对陈氏新银鱼的保护工作刻不容缓。近年来，微卫星标记在种群结构的研究中发挥了很大的作用。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足提供陈氏新银鱼微卫星位点、引物及其应用。

本发明的技术方案如下：

陈氏新银鱼微卫星位点，包括12个稳定的多态性微卫星位点，其序列分别如SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：12所示。

所述的陈氏新银鱼微卫星位点的引物，其序列分别如SEQ ID NO：13-SEQ ID NO：36所示。

所述的陈氏新银鱼微卫星位点或者所述的引物的应用，包括分子生态学研究，谱系分析，种质资源调查，辅助育种和个体识别，所述12个稳定的多态性微卫星位点组合使用，或者其对应的引物组合使用。

本发明公开了陈氏新银鱼的12条微卫星序列及12对微卫星引物。这些位点在对陈氏新银鱼的保护遗传学研究、种质资源调查和辅助育种中起到重要作用。

附图说明

图1为陈氏新银鱼模板；1-8：陈氏新银鱼基因组DNA抽提结果；M：Trans2K DNA Marker；Y：空白对照；

图2为陈氏新银鱼菌落PCR；1-24：部分菌落PCR结果，其中8、11、13、15、19、21为阳性重组子；M：Trans2K DNA Marker(同图1)；

图3为陈氏新银鱼微卫星扩增抽检结果；1-8：部分微卫星位点扩增结果；M：Trans2K DNA Marker(同图1)；

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。

1、DNA抽提

利用肌肉或者血液组织，提取陈氏新银鱼的基因组DNA。基因组DNA的抽提采用SDS/蛋白酶K裂解、酚-氯仿抽提途径(Sambrook et al.，1999)，见图1。

2、陈氏新银鱼微卫星富集文库的筛选

酶切连接  利用提取基因组DNA，用限制性内切酶Sau3AI进行部分酶切，然后与Sau3AI的接头(A)5’-GATCGTCGACGGTACCGAATTCT/(B)3’-CAGCTGCCATGGCTTAAGA ACTG进行连接。

陈氏新银鱼基因组PCR文库的构建将消化产物稀释十倍以后，用连有接头的DNA片段作为模板，寡聚核苷酸链B为引物，进行PCR扩增，创建基因组PCR文库。程序为94℃预变性5min，94℃30sec，53℃1min，72℃1min，26个循环，最后72℃延伸8min。扩增产物在1％的琼脂糖凝胶电泳检测。

用生物素标记的微卫星探针筛选10μmol/L生物素标记的(AG)₈/(AC)₈探针，50μmol/L引物(为寡聚核苷酸链B)、20×SSC、10％SDS、ddH₂O。将双链DNA片段95℃变性5min，立即加入68℃预热的反应液中，68℃温育1h。杂交过程中平衡磁珠。

磁珠的平衡将磁珠(Dynal A.S产品)轻轻摇匀，吸出300μl到500μl的硅化离心管中，放在磁力架上1～2min，轻轻吸出上清液。用300μl0.5×SSC洗涤3次后，重悬磁珠于100μl0.5×SSC中，将杂交液加入其中。25℃温育10min，每1～2min轻摇一次。