[发明专利]一种检测肠癌热点基因突变位点的组合物及其使用方法

权利要求书

1.一种检测肠癌热点基因突变位点的组合物，其特征在于，所述组合物包括SEQ NO：1至SEQ NO：17的引物序列，还包括SEQ NO：18至SEQ NO：21的block序列。

2.如权利要求1所述的检测肠癌热点基因突变位点的组合物，其特征在于，所述组合物在用于PCR扩增时的反应体系为：1～10×PCR缓冲液、0.1～1mM dNTPs、0.1～1uM正向引物、0.1～1μM反向引物、0.1～2μM block、0.05～2ng/μL模版DNA、Eva Green染料0.5～2μL、0.01～0.10U/μl TaqDNA聚合酶、1～5mM氯化镁。

3.如权利要求1或2所述的检测肠癌热点基因突变位点的组合物，其特征在于，所述block序列为PCR扩增反应中所用，是一段与野生型DNA序列完全匹配的可偏向性扩增突变DNA序列的突变型特异性引物。

4.如权利要求1～3所述的检测肠癌热点基因突变位点的组合物的使用方法，其特征在于，所述使用方法的步骤为：

第一步：将待测样品、阴性质控品、阳性质控品和无模版对照进行PCR扩增反应，其中，所述PCR扩增反应以待测DNA为模板，设计针对目的基因突变位点的特异性引物，同时加入LNA锁核酸修饰，通过对待测DNA样品中的目的基因进行偏向性PCR扩增反应；

第二步：根据仪器检测结果中Ct值和MeltCure的判读，判断所述待测样品中目的基因的突变情况。

5.根据权利要求4所述的检测肠癌热点基因突变位点的组合物的使用方法，其特征在于，通过PCR扩增反应结果中扩增曲线和熔解曲线主峰来鉴别DNA特定突变。

6.根据权利要求4所述的检测肠癌热点基因突变位点的组合物的使用方法，其特征在于，所述根据Ct值和MeltCure的判读来判断待测样品中目的基因的突变情况，其具体步骤为：

1).运行CT值的计算，无模板对照应无特异扩增，或仅引物二聚体导致的荧光信号增强；当Ct值≥45.0时，表明无模板对照有微弱的扩增，对试验的影响极微，可以继续分析试验情况；

2).运行内控，一般Ct值＜40.0，可以继续分析，如果Ct值≥40.0，则说明样品DNA降解严重，不适合试验需要；

3).运行阳性质控品，阳性质控的Ct值＜45.0，熔解曲线最高峰的Tm值在相应突变的范围内，说明试验体系正常，可以继续分析试验结果；

4).符合上述条件，运行Tm calling程序，通过熔解曲线分析和Ct值，判读样本是否存在突变：运行Tm calling程序，若样本熔解曲线最高峰的Tm值在相应突变的范围内，并且Ct＜45，表明扩增区段发生突变；若样本存在以下三种情况之一，则判断为阴性：a，无扩增；b，有扩增，Ct≥45；c，有扩增，Ct＜45，但是运行Tm calling程序，熔解曲线最高峰的Tm值不在相应突变的范围内；

5).如果不符合上述第1、3项要求，建议重做本次实验；如果不符合第2项要求，建议重新从样本中提取DNA，再次检测。

7.根据权利要求4所述的检测肠癌热点基因突变位点的组合物的使用方法，其特征在于，所述待测样品为人类基因组DNA，所述阳性质控品为含有KRAS、BRAF、PIK3CA基因突变的混合质粒或者纯合质粒，所述阴性质控品为不含有KRAS、BRAF、PIK3CA基因突变的混合质粒或者纯合质粒。

8.根据权利要求4所述的检测肠癌热点基因突变位点的组合物的使用方法，其特征在于，所述待测DNA为人类正常DNA、细胞DNA、肿瘤组织基因组DNA、外周血细胞DNA、外周血血清或血浆DNA、体液DNA或排泄物细胞DNA。

9.根据权利要求4所述的检测肠癌热点基因突变位点的组合物的使用方法，其特征在于，所述肠癌热点基因为KRAS、BRAF、PIK3CA基因野生型和KRAS、BRAF、PIK3CA基因突变型。

10.根据权利要求9所述的检测肠癌热点基因突变位点的组合物的使用方法，其特征在于，所述KRAS、BRAF、PIK3CA基因包含G12R、G12S、G12C、G12A、G12D、G12V、G13D、E542K、E545K、E545D、H1047L、H1047R、H1047、V600E。