[发明专利]一种特异识别大鼠成骨细胞的寡核苷酸配基的序列和应用

说明书

技术领域

本发明属于分子生物医学技术领域，具体涉及特异识别大鼠成骨细胞的寡核苷酸配基L54的序列和修饰，以及修饰后的L54在识别大鼠成骨细胞方面的应用。本发明涉及L54在生物医药方面的应用。L54作为试剂盒的组成部分或者检测指标，用于骨质疏松、骨关节炎等骨代谢相关疾病的辅助诊断，治疗骨质疏松、骨关节炎等骨代谢相关疾病，以及用于关于骨代谢疾病发生、发展、进程相关的基础研究等。L54作为载体递送药物靶向骨代谢相关疾病靶向治疗方面的应用。

背景技术

指数富集的配基系统进化技术，简称SELEX(SystematicEvolutionofLigandsbyEXponentialEnrichment)技术，是一种新型的高通量生物文库筛选技术。这种技术运用大容量的随机寡核苷酸文库(ssDNA文库和RNA文库)，同时结合体外PCR扩增技术，以指数形式富集与靶分子特异性结合的寡核苷酸，经过反复的体外筛选、扩增，最终获得基于空间结构与靶分子呈高特异性和高亲和力的结合寡核苷酸配基-适配体(aptamer)。由于aptamer具有精确识别、无免疫原性、易体外合成与修饰等优点，又称为“人工替代抗体”，在基础医学、临床诊断与新药研发等方面具有广阔的应用前景。随机文库中的寡核苷酸序列能形成多样的空间结构，因此SELEX技术可选择的靶分子范围十分广泛，包括金属离子、蛋白多肽、有机染料等，其中蛋白多肽类靶分子最多，包括酶、生长因子、抗体、转录因子、细胞粘附分子和选择素等。完整的病毒颗粒、细菌病原体，甚至完整的哺乳动物细胞也可以通过完整细胞消减SELEX技术筛选出其高亲和力的寡核苷酸配基。SELEX技术作为一种极其有用的分子生物学工具而越来越受到重视，并在基础医学、临床诊断和疾病治疗中都显示了广阔的应用前景。

本发明是通过完整细胞消减SELEX技术获得了一个寡核苷酸配基L54。经鉴定L54能够特异识别大鼠成骨细胞，而不结合其它细胞，对照核酸序列与上述细胞均无结合，目前尚未见能特异结合大鼠成骨细胞的核酸适配体的相关研究报道。

发明内容：

本发明目的在于提出特异识别鼠成骨细胞的寡核苷酸配基L54的序列及其应用领域，包括L54作为试剂盒的组成部分或者检测指标，用于骨质疏松、骨关节炎等骨代谢相关疾病的辅助诊断，治疗骨质疏松、骨关节炎等骨代谢相关疾病，以及用于关于骨代谢疾病发生、发展、进程相关的基础研究等。L54作为载体递送药物靶向骨代谢相关疾病靶向治疗方面的应用。

本发明通过以下技术方案实现：

首先由Invitrogen公司合成L54序列，并在5’端或3’端修饰、标记(如FAM、生物素或者同位素)，然后进行应用研究：组织化学或荧光方法检测L54识别大鼠成骨细胞。

本发明优点：

1)与蛋白类的抗体相比，单链的寡核苷酸更加稳定；aptamer可直接体外合成、标记，因此不需要标记的二抗，使得操作更为简单、迅速；aptamer的合成成本较抗体制备成本低，周期短。

2)本发明证实L54能够特异识别大鼠成骨细胞。因此，L54序列在临床医学与基础医学的肿瘤研究相关领域中均具有广泛的应用价值和广阔的市场前景。

附图说明：

图1流式细胞仪测定L54与大鼠成骨细胞的结合情况。

图2流式细胞仪测定L54与大鼠骨肉瘤细胞的结合情况。

图3流式细胞仪测定L54与大鼠肠上皮细胞的结合情况。

图4L54与大鼠成骨细胞结合的平衡解离常数(KD值)的测定。

具体实施方式：

下面通过FAM标记的L54对大鼠成骨细胞的识别来进一步描述本发明。

1、合成L54序列(序列表中SEQIDNo.1)和GP30序列(序列表中SEQIDNo.2)，均在5’端标记FAM(Invitrogen公司完成)。

FAM-L54

5’-GTACTTCCGGCGGGTTCTATGGGCCCTGTCTCCCTTCCCAAAAGTGCACGCTAC-3’

FAM-GP30：

5’-GCAATGGTACGGTACTTCCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA-3’

注：N代表A、T、G、C任意一种。

2、流式细胞仪分别测定FAM-L54与大鼠成骨细胞、大鼠骨肉瘤细胞、大鼠肠上皮细胞的结合