[发明专利]基于拯救重组狂犬病弱毒的新型中和抗体检测方法

说明书

技术领域

本发明属于狂犬病病毒中和抗体的检测技术领域，尤其涉及一种基于拯救重组狂犬病弱毒的新型中和抗体检测方法。

背景技术

狂犬病(Rabies)是由嗜神经性的狂犬病病毒(Rabies Virus，RV)引起的人兽共患的世界性传染病，是一种古老的疾病，能感染所有温血动物。全球每年死于狂犬病的人数约55000人(WHO数据)，主要集中在亚洲和非洲等一些落后的国家和地区。我国患狂犬病人数呈现逐年上升趋势，仅次于印度，狂犬病已成为我国关注的公共卫生问题之一。一旦出现狂犬病症状，致死率接近100％，目前尚无有效治疗药物。犬是我国人类狂犬病的主要传染源，占85％～95％，因此，加强犬的暴露前免疫和人暴露后处理是防制狂犬病的根本措施。WHO规定，人和动物血清中狂犬病病毒中和抗体效价大于0.5IU/mL时，即可获得完全保护。70％的犬获得免疫时，基本上可控制犬对人类的传播。随着免疫密度的加大，需要建立有效的检测手段来监控免疫效果。

目前，狂犬病病毒中和抗体定量检测的方法主要有小鼠血清中和试验、空斑减少中和试验、间接免疫荧光试验、快速免疫荧光灶抑制试验(RFFIT)和荧光抗体病毒中和试验(FAVN)。其中，WHO和OIE分别推荐RFFIT和FAVN作为狂犬病病毒中和抗体的标准检测方法。这两种方法检测结果一致性好，在结果判定时，受主观因素影响较小。然而，RFFIT和FAVN以狂犬病病毒CVS-11株作为标准攻毒株，毒力较强，存在潜在的安全隐患；同时操作较复杂，需要严格的实验室条件和熟练的操作人员；而且需要质量好且昂贵的特异性抗狂犬病病毒的一抗和FITC标记的二抗，不利于基层检测狂犬病病毒中和抗体水平。因此，建立新型安全、经济、快速的狂犬病病毒中和抗体检测方法是现实需要。

我国的家犬数量庞大，主要养于农村，狂犬病也主要发生在农村。目前对狂犬病血清抗体的监测主要依赖于地级市和县二级的疫控中心或动物疫控中心，因此尽可能简便、易操作、特异、敏感的方法才可能被推广应用。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种特异性强、灵敏度高、安全经济、操作快速简便的基于拯救重组狂犬病弱毒的新型中和抗体检测方法，以方便基层和现场检测人和犬等动物血清中狂犬病中和抗体滴度。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：基于拯救重组狂犬病弱毒的新型中和抗体检测方法，利用反向遗传学技术拯救出具有融合表达增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein，eGFP)的狂犬病弱毒株rRV-eGFP，将该毒株与56℃30min灭活的待检血清37℃作用一小时后，接种到BHK-21细胞上，48小时后直接在荧光显微镜观察结果。

上述基于拯救重组狂犬病弱毒的新型中和抗体检测方法，利用两倍系列稀释的预灭活的犬或人血清与等体积的100TCID₅₀的rRV-eGFP株混匀，于37℃5％CO₂作用1小时后接种到约2×10⁴个BHK-21的96孔板中，于37℃5％CO₂培养箱培养48小时，直接在倒置荧光显微镜下观察有无绿色荧光。

上述基于拯救重组狂犬病弱毒的新型中和抗体检测方法，包括以下步骤：

(1)血清的准备

将待检测和OIE标准血清于56℃水浴作用30分钟，取100μL犬或人血清按两倍系列稀释(2^-1～2^-7)；

(2)血清与重组病毒相互作用

分别取50μL系列稀释好的血清于灭菌离心管中，每个稀释度设3个重复，每管加入等体积100TCID₅₀的重组病毒液，混匀，于37℃培养箱作用1小时；

(3)取上述处理的100μL血清与病毒混合液加入到事先培养成2×10⁴个BHK-21细胞的96孔板中，于37℃5％CO₂孵育1小时，吸出血清与病毒混合液，加入含2％胎牛血清的DMEM，于37℃5％CO₂温湿培养箱中培养48小时，直接在倒置荧光显微镜下观察有无绿色荧光。

狂犬病弱毒株rRV-eGFP的制备方法，包括以下步骤：

(1)重组狂犬病病毒rRV-eGFP的感染性cDNA构建

利用反向遗传学技术，将eGFP基因与狂犬病病毒弱毒株RC-HL的感染性cDNA的P基因融合，具体操作过程按以下步骤进行：