[发明专利]基于DNA条形码的鉴别乌梢蛇的引物及PCR-RFLP方法和试剂盒

权利要求书

1.用于鉴别乌梢蛇PCR-RFLP方法的PCR扩增引物，其特征在于，所述引物序列为：

DK1-CO1：5’-CAACTAACCACAAAGACATCGG-3’；

DK1-CO2：5’-CTTCTGGGTGGCCGAAAAATCA-3’。

2.一种乌梢蛇的PCR-RFLP鉴定方法，其特征在于，利用能够识别乌梢蛇特征DNA碱基序列5’-ACTAGT-3’的限制性内切酶Spe I，与不能识别乌梢蛇特征DNA碱基序列5’-GGAAACC-3’的限制性内切酶BstE II，共同对纯化后的PCR产物进行消化，产生琼脂糖凝胶电泳的特征图谱；所述鉴定方法包括以下步骤：

1)样品DNA的提取；

2)扩增DNA片段：利用权利要求1所述的引物进行聚合酶链反应，得到聚合酶链反应扩增产物，所述PCR反应参数包括：93℃预变性5min，55℃2min；93℃变性30s，55℃复性45s，70℃延伸45s，35个循环；70℃延伸5min；

3)琼脂糖凝胶电泳检测，纯化PCR产物；

4)在所述PCR纯化产物中加入限制性内切酶Spe I和BstE II进行双酶切，所述限制性内切酶Spe I的酶切位点为A^CTAGT；所述限制性内切酶BstE II的酶切位点为G^GTNACC；

5)琼脂糖凝胶电泳分析；

6)鉴定结果的判断：若在所述电泳产物中检测到分子量为121bp和537bp的两条片段，则待测样品为乌梢蛇；若不出现上述两条片段或多于两条片段，则供试品不为乌梢蛇。

3.一种用于乌梢蛇PCR-RFLP鉴定方法的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：10μM引物DK1-CO1；10μM引物DK1-CO2；2×Taq DNA聚合酶混合缓冲液，其包括：0.1U/μL Taq DNA聚合酶，dATP、dTTP、dCTP及dGTP各500μM，20μMTris-HCl、pH8.3，100μM KCl，3μM MgCl₂；10U/μL Spe I酶；10U/μL BstE II酶；酶切缓冲液；终止缓冲液；灭菌双蒸水。