[发明专利]一种羊棘球蚴ELISA抗体检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术和诊断试剂领域，具体涉及一种羊棘球蚴ELISA抗体检测试剂盒。

背景技术

棘球蚴病又称包虫病，是由寄生于犬、狼、狐狸等动物小肠的细粒棘球绦虫中绦期—棘球蚴感染中间宿主而引起的一种严重的人兽共患病。棘球蚴寄生于、羊、猪、马、骆驼等家畜及多种野生动物和人的肝、肺及其他器官内。由于蚴体生长力强，体积大，不仅压迫周围组织使之萎缩和功能障碍，还易造成继发感染，如蚴体破裂，还可引起过敏反应，往往给人畜造成严重的病症，甚至死亡。

1996年Lightowler等研制成功抗细粒棘球绦虫虫卵感染的基因工程重组抗原疫苗—Eg95疫苗，为包虫病的免疫预防带来新的希望。初步的动物实验表现了不错的抗感染能力(96%～98%)，Eg95疫苗由此也被认为是最有前途的抗细粒棘球绦虫疫苗。经过多年的发展，EG95重组蛋白疫苗作为目前控制棘球蚴病唯一的疫苗，完全能够用于动物的免疫预防，且已实现商品化生产。但目前尚无简单有效、特异性、敏感性强的免疫学检测试剂盒，以评价疫苗的免疫效果、促进EG95重组蛋白疫苗的应用。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种羊棘球蚴ELISA抗体检测试剂盒，能够用于羊棘球蚴病抗体的定性检测，具有特异性好、灵敏度高、重复性好的优点。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

本发明公开了一种羊棘球蚴ELISA抗体检测试剂盒，所述检测试剂盒包括羊棘球蚴重组抗原Eg95预包被酶标板、样品稀释液、阳性对照液、阴性对照液、酶结合物、洗涤液、底物显色液和终止液。

进一步，所述羊棘球蚴重组抗原Eg95是通过以下方法制备的：首先PCR扩增EG95基因片段，然后采用EcoR I和Xho I同时酶切PCR产物和原核表达载体pET-32a，胶回收目的片段和载体后进行连接，构建重组质粒pET-EG95，将重组质粒转化到大肠杆菌，经IPTG诱导表达，经Ni-NTA纯化。

进一步，所述抗原包被的方法为：将纯化的重组蛋白Eg95用pH9.6的碳酸盐缓冲液稀释至10μg/ml，包被酶标板，每孔100μl，4℃过夜，用洗涤液洗5次，每次3min；加入含5% wt.脱脂奶粉的PBS封闭液，每孔200μl，37℃孵育2h，随后用洗涤液洗5次，每次3min，真空包装后置于4℃保存备用。

进一步，所述样品稀释液为含5%wt.BSA和0.5‰wt.Tween-20的磷酸盐缓冲液。

进一步，所述阴性对照液为健康未免疫棘球蚴疫苗的羊血清，所述阳性对照液为含有Eg95抗体的羊血清。

进一步，所述酶结合物为辣根过氧化物酶标记的兔抗山羊IgG酶标抗体。

进一步，所述洗涤液为含0.5‰wt.Tween-20的磷酸盐缓冲液。

进一步，所述底物显色液包括溶液A和溶液B，溶液A的配方为：每500ml加醋酸钠13.6g、柠檬酸1.6g和30%双氧水0.3ml，溶液B的配方为：每500ml加乙二胺四乙酸二钠0.2g、柠檬酸0.95g、甘油50ml和TMB粉末0.15g。

进一步，所述终止液为2mol/L的硫酸溶液。

本发明的有益效果在于：本发明以重组蛋白Eg95为抗原来检测羊棘球蚴病抗体，经试验证明，该抗体检测试剂盒特异性强、灵敏度高、试剂盒稳定性好，可用于羊棘球蚴病抗体的定性检测。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1： 棘球蚴重组蛋白Eg95表达的SDS-PAGE分析结果。1.蛋白Marker；2-7.重组蛋白Eg95；

图2：棘球蚴重组蛋白Eg95表达的Western blotting分析结果。1.蛋白Marker；2.阴性对照；3.重组蛋白Eg95；

图3：棘球蚴重组蛋白Eg95纯化结果。1.蛋白Marker；2-11重组蛋白Eg95；

图4：羊棘球蚴ELISA抗体检测试剂盒的灵敏性试验结果。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，下面将对本发明的优选实施例进行详细的描述。

实施例1：羊棘球蚴ELISA抗体检测试剂盒的制备

羊棘球蚴ELISA抗体检测试剂盒包括羊棘球蚴重组抗原Eg95预包被酶标板、样品稀释液、阳性对照液、阴性对照液、酶结合物、洗涤液、底物显色液和终止液。

羊棘球蚴ELISA抗体检测试剂盒的制备方法为：