[发明专利]4H-[1]-苯并吡喃[4,3-b]噻吩-2-甲酸酰肼及其衍生物在糖蛋白特异性荧光预染检测法中的应用

说明书

本发明涉及糖蛋白特异性荧光预染检测法检测技术，具体地说是4H‑[1]‑苯并吡喃[4，3‑b]噻吩‑2‑甲酸酰肼及其衍生物在糖蛋白特异性荧光预染检测法中的应用。本发明还提供了应用4H‑[1]‑苯并吡喃[4，3‑b]噻吩‑2‑甲酸酰肼进行糖蛋白特异性荧光预染检测的方法，包括步骤：向蛋白质样品中加入高碘酸溶液进行氧化；加入抗坏血酸溶液中和过量高碘酸溶液；加入染料反应；加入上样缓冲液；电泳；观察。本预染发明具有灵敏度高、选择性好、操作简单迅速、重现性好、线性关系好、质谱兼容性好、使用安全、成本低廉等优点。此外相对于凝胶电泳后糖蛋白染色方法，预染检测法在电泳结束后即可观察，节省了凝胶电泳后染色步骤，可较好地适用于高通量蛋白质组学的研究。

技术领域

本发明涉及糖蛋白特异性荧光预染检测技术，具体地说是4H-[1]-苯并吡喃[4，3-b]噻吩-2-甲酸酰肼及其衍生物在糖蛋白特异性荧光预染检测法中的应用。

背景技术

蛋白质糖基化修饰在生命科学研究领域具有至关重要的作用，作为最主要和普遍的蛋白质翻译后修饰之一，目前已知哺乳动物蛋白质中至少有二分之一发生了糖基化，这些糖蛋白广泛分布于组织、细胞、体液中，特别是在细胞膜表面、体液等中含量丰富，糖基化对于蛋白质的折叠、运输和定位等都起着重要作用，并参与受体激活、信号转导、细胞载附等诸多重要的生物过程。糖蛋白数量变化或糖链结构的改变，都可能导致疾病发生。不但目前已知的很多疾病的诊断标志物是糖蛋白，而且通过国际标准认证的药物中，糖蛋白也占到较高的比例。

分离纯化及鉴定是糖蛋白研究的重要步骤，是下一步结构分析得以实施的基础。目前凝胶上蛋白质染色主要分为预染及后染两类。前者在电泳前对样品进行处理，使染料特异性地与样品内糖蛋白相结合，经电泳分离之后即可在相应激发波长下进行观察，后染主要对电泳后的蛋白凝胶进行特异性染色。

目前糖蛋白检测领域试剂盒主要集中于后染，且多数产品均以高附加值的价格在市场销售，价格高昂，不利于生物技术基础研究的发展。尤其国内利用现有的生物试剂进行生物实验成本居高不下，无法实现经济效益与实验共同发展。糖蛋白特异性荧光预染检测技术鲜有报道。本发明开发的4H-[1]-苯并吡喃[4，3-b]噻吩-2-甲酸酰肼及其衍生物荧光预染检测方法灵敏度接近Pro-Q Emerald488染色法，是一种灵敏、便捷、特异的糖蛋白荧光预染检测技术，有较好的基础与临床意义。

发明内容

本发明的目的在于提供4H-[1]-苯并吡喃[4，3-b]噻吩-2-甲酸酰肼及其衍生物在糖蛋白特异性荧光预染检测中的应用。

本发明所述的4H-[1]-苯并吡喃[4，3-b]噻吩-2-甲酸酰肼相关化合物是指以4H-[1]-苯并吡喃[4，3-b]噻吩-2-甲酸酰肼阴离子为母核的钠盐、钾盐和铵盐等。

4H-[1]-苯并吡喃[4，3-b]噻吩-2-甲酸酰肼母核为：

为了实现本发明的目的，本发明还提供了应用4H-[1]-苯并吡喃[4，3-b]噻吩-2-甲酸酰肼进行糖蛋白特异性荧光预染检测的方法包括如下步骤：

1)在1-20μL含0.5-10μg蛋白样品(不足1-20μL用重蒸水补足)中加入0.005-0.05M高碘酸水溶液1-20μL，置于避光处进行氧化反应5-30min；优选的样品体积为10μL，优选的高碘酸摩尔浓为0.03M，体积为10μL，优选的反应时间是10min；

2)在反应液中加入0.1-0.3M抗坏血酸1-10μL，摇匀反应0.5-5min；优选的抗坏血酸摩尔浓度是0.24M，体积为5μL，优选的反应时间是1min；