[发明专利]一种爱德华氏菌的灭活方法及其灭活疫苗

说明书

技术领域

本发明涉及鱼用疫苗领域，具体说是巯基试剂作为灭活剂，对爱德华氏菌的灭活方法及其制备的灭活疫苗。

背景技术

爱德华氏菌(Edwardsiella sp.)包括迟缓爱德华氏菌(E.tarda)、鲇鱼爱德华氏菌(E.ictaluri)和保科爱德华氏菌(E.hoshinae)，是水产养殖中的主要病原菌之一，其宿主范围十分广泛，鱼类、两栖类、爬行类、鸟类以及包括人类的哺乳类都有感染报道，且呈世界性分布，普遍存在于淡水和海水环境中，主要分布在中国、澳大利亚、日本、印度、以色列、马来群岛、美国、巴拿马等热带和亚热带国家和地区。从首次报道至今，该菌在多种养殖鱼类中引发了病害并造成了巨大损失。目前在鱼类疾病防治中常采用化学治疗剂以及抗生素，但随着它们的使用，病原耐药性也随之增强，而且药物残留和在环境中的扩散已经引起了食品安全、环境及公共卫生方面的问题。鱼用疫苗使用后不会产生污染，不会在免疫鱼体内形成残留，可以避免环境污染并维持鱼体本身的品质，反复使用也不会产生耐药性，应用前景广阔。

目前，目前，鱼用疫苗在应用中，包括有灭活疫苗、减毒活疫苗、DNA疫苗、亚单位疫苗和菌蜕疫苗等形式，其中灭活疫苗研发周期短、制作成本低、安全性好，在免疫效率得到保证的情况下最容易获得批准，因此成为目前商业化疫苗的最主要种类。但研究表明，爱德华氏菌与弧菌等许多病原菌不同，采用常规技术制备的爱德华氏菌灭活疫苗对受试鱼不能产生有效的免疫保护性。Gutierrez和Miyazaki(1994,Dis Aquat Org.6:110–117.)研究中福尔马林灭活的迟缓爱德华氏菌注射免疫日本鳗的相对保护率仅为12.5—25％，我们前期实验采用未经优化的常规技术制作的爱德华氏菌灭活疫苗的相对保护率(RPS)也不到40％；Mekuchi等(1995,Fish Pathol.30(4):251-256)分别采用肌肉注射、浸泡或口服的接种方式用福尔马林灭活的迟缓爱德华氏菌免疫牙鲆，但均没有取得有效的免疫保护效果；Sun等(2011,Fish Shellfish Immunol.31(4):595-599.)虽然也报道了爱德华氏菌的灭活疫苗，爱德华氏菌的单价灭活疫苗的免疫保护率只有33.3％，只有当灭活的爱德华氏菌与鳗弧菌等另三种菌联合使用时，才能获得较好的免疫保护率，鳗弧菌等其他三种菌灭活疫苗其实为爱德华氏菌灭活疫苗起到了免疫佐剂的作用。总体来说，结合我们自己的多次实验结果以及大多数的报道，爱德华氏菌灭活疫苗的免疫效果不尽理想的现状，这也可能是人们不得不花更大的代价进行其他种类的疫苗的研究的原因。

爱德华氏菌的弱毒活疫苗的应用报道中，Klesius等(2000)的发明(US Patent 6153202)公开了一种鲶鱼爱德华氏菌减毒活疫苗，Evans等(2006)的发明(US Patent 7067122)公开了一种基因修饰的迟缓爱德华氏菌的活疫苗，王启要等(2010)的发明(201010541646.2)公开了一株迟缓爱德华氏菌基因缺失弱毒活疫苗。这些专利说明减毒疫苗在爱德华氏菌疫苗研究中得到了更多的重视。减毒疫苗虽然能保证爱德华氏菌疫苗的免疫保护率，但由于减毒疫苗仍然存在一定的生物安全风险，在安全性评价上需要更为谨慎，使得这种疫苗研制和实现商业化的周期长，代价高。另外由于不同疫苗都存在一定的特异性，一旦有不同种或不同血清型的爱德华氏菌的威胁，这种减毒疫苗可能就不再发挥免疫保护作用。爱德华氏菌的其他类新型疫苗，如DNA疫苗、亚单位疫苗和菌蜕疫苗等，虽然也具有一定的免疫效果，但考虑到生产工艺，成本，安全性等问题，上述疫苗目前也难以投入到实际应用中。

发明内容

本发明的目的是提供一种有效维持爱德华氏菌抗原免疫保护力的灭活方法及其灭活疫苗以及该灭活疫苗的应用，以克服现有技术的不足。

为实现上述目的，本发明所述的爱德华氏菌的灭活方法，即采用巯基灭活剂对爱德华氏菌进行灭活处理，能够维持爱德华氏菌抗原的免疫原性。

优选的，对爱德华氏菌采用最低灭活强度进行灭活处理，所述最低灭活强度即为最低剂量的巯基灭活剂、最低灭活温度和最短灭活时间之间组合，且三者之间互为负相关。