[发明专利]一种1,3‑1,4‑β‑葡聚糖酶突变体

权利要求书

1.一种1,3-1,4-β-葡聚糖酶突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列如以下(1)或(2)或(3)或(4)或(5)所示：

(1)SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，

(2)SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，

(3)SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列，

(4)SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列，

(5)在(1)或(2)或(3)或(4)的氨基酸序列基础上经过一个或者几个氨基酸取代、缺失或者添加，且具有1,3-1,4-β-葡聚糖酶活性的氨基酸序列。

2.编码权利要求1所述突变体的基因。

3.携带权利要求2所述基因的载体或重组细胞。

4.一种获得权利要求1所述1,3-1,4-β-葡聚糖酶突变体的方法，其特征在于，是以野生1,3-1,4-β-葡聚糖酶的基因为模板，采用重叠延伸PCR的方法进行定点突变获得编码突变体的基因，随后将编码突变体的基因片段进行重组表达获得突变体。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，对于氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示的β-葡聚糖酶单突变体K20S、K117S和K165S的构建，以野生酶基因为模板，分别将第20位、117位和165位的赖氨酸通过重叠延伸PCR突变为丝氨酸。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，对于氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示的三突变体K20S/K117S/K165S的构建，先后将第20位、117位和165位的赖氨酸通过重叠延伸PCR突变为丝氨酸。

7.根据权利要求4-6任一所述的方法，其特征在于，以pET28a(+)为表达载体，以大肠杆菌为表达宿主。

8.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，以TB液体培养基为发酵培养基，重组菌在37℃培养至OD₆₀₀＝0.8-1.0，加入IPTG和α-乳糖诱导表达，将所得菌液离心后弃菌体，收集含有1,3-1,4-β-葡聚糖酶突变体的上清。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，上清经过Ni-NTA亲和层析柱纯化以及GE PD-10柱脱去咪唑，得到1,3-1,4-β-葡聚糖酶突变体。

10.权利要求1所述突变体在啤酒生产中的应用。