[发明专利]重组类人胶原蛋白-人细胞生长因子融合蛋白及其制备方法与应用

说明书

技术领域

本发明涉及到基因工程领域，通过基因重组的方法获得了重组类人胶原蛋白-人细胞生长因子融合蛋白。具体而言，本发明涉及一种重组类人胶原蛋白-人细胞生长因子融合蛋白的制备方法及其应用。

背景技术

近年来随着生物技术和材料科学的进步，对于以往常规治疗方法难以缝扎和植皮的重度渗血创面治疗有了很大进步，治疗目的也从原来单纯要求创面闭合或瘢痕愈合，提高到了尽量少留瘢痕、追求结构和功能完美修复的高度(付小兵.创伤修复与组织再生面临的新课题[J].临床外科杂志，2007，15(11)：739-740)。临床现有的生长因子在创伤愈合中具有显著优势，但对常规方法难以处理的创面应用时存在活性丧失快、半衰期短需频繁反复用药的缺陷。胶原蛋白是一种生物性高分子物质，在动物细胞中扮演结合组织的角色，为生物科技产业最具关键性的原材料之一，也是需求量十分庞大的最佳生医材料，广泛应用于生医材料、化妆品和食品工业等领域。负载有生长因子的胶原蛋白海绵兼有组织修复、残腔填充、止血、药物载体和防粘连的作用，在各类手术中已广泛应用，但目前获取的胶原蛋白成熟的工艺是采用动物组织提取的方式，存在哺乳动物牛组织及鸟类动物鸡组织中提取的胶原蛋白易带病毒，继而传染并危害人的健康的风险。为探讨操作简便、高效快速的创伤治疗新方法，本发明人致力于新型重组人胶原蛋白-人细胞生长因子融合蛋白的研究，并在此基础上，完成了本发明。

本发明的重组类人胶原蛋白-人细胞生长因子融合蛋白不仅能使创伤面快速止血、愈合，促进创伤部位血管和神经的修复再生，而且其半衰期较单独人表皮生长因子长，活性保存时间长，不易丧失。重组类人胶原蛋白-人细胞生长因子融合蛋白复配以适当辅料后，可进一步制备成冻干粉剂、纳米微球、纳米脂质体、水剂、凝胶等半固体制剂，作为活性添加剂应用于组织工程、药学以及美容护肤领域。本发明的重组类人胶原蛋白-人细胞生长因子融合蛋白具有人源化，免疫原性低，不易发生过敏反应的突出优点。

发明内容

本发明公开了一种重组类人胶原蛋白-人细胞生长因子融合蛋白的制备方法及其应用。

具体而言，本发明的重组类人胶原蛋白-人细胞生长因子因子融合蛋白的制备方法包括下述步骤：获得编码所述融合蛋白的DNA序列，构建适当的重组表达载体在大肠杆菌、毕赤酵母或中国仓鼠卵巢细胞表达所述融合蛋白。

本发明还涉及构成本发明的重组类人胶原蛋白-人细胞生长因子融合蛋白的氨基酸序列，编码本发明的重组类人胶原蛋白-人细胞生长因子融合蛋白的核苷酸序列，表达本发明的重组类人胶原蛋白-人细胞生长因子融合蛋白的重组载体，和表达本发明的重组类人胶原蛋白-人细胞生长因子融合蛋白的宿主细胞，所述宿主细胞选自细菌(如大肠杆菌细胞)、酵母细胞(如毕赤酵母细胞)、动物细胞(如中国仓鼠卵巢细胞)，其中优选表达宿主为中国仓鼠卵巢细胞，更优选的为毕赤酵母细胞，最优选为大肠杆菌细胞。

本发明的重组类人胶原蛋白-人细胞生长因子融合蛋白包括与人胶原蛋白至少85％序列同源性的第一区和与人细胞生长因子至少85％序列同源性的第二区。本发明融合蛋白的第一区与第二区之间设有连接肽，连接肽的通式是(GGGS)_n，n＝1～5的整数，优选n＝3。

根据本发明的某些实施方案中的一个方面，提供了一种重组类人胶原蛋白-人细胞生长因子融合蛋白，其特征在于包括与人胶原蛋白至少85％序列同源性的第一区和与人细胞生长因子至少85％序列同源性的第二区。

根据本发明的某些实施方案中的一个方面，提供了一种重组类人胶原蛋白-人细胞生长因子融合蛋白，其特征在于包括与人胶原蛋白氨基酸残基序列相同的第一区和与人细胞生长因子氨基酸残基序列相同的第二区，或上述二区的功能同等物。其中所述人细胞生长因子选自aFGF、bFGF、EGF或NGF。其中，所述第一区的氨基酸序列为SEQ ID NO.1：

MTS(GERGDLGPQGIAGQRGVVGERGERGERGASGERGDLGPQGIAGQRGVVGER GERGERGAS)×8

其中包括八次GERGDLGPQGIAGQRGVVGERGERGERGAS GERGDLGPQGIAGQRGVVGERGERGERGAS序列重复。

根据本发明的某些实施方案中的一个方面，提供了一种重组类人胶原蛋白-人细胞生长因子融合蛋白，其特征在于所述与人胶原蛋白同源的第一区位于融合蛋白的C-末端，与人细胞生长因子同源的第二区位于融合蛋白的N-末端。