[发明专利]一种微球荧光强度标准物质的定值方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种标准物质的定值方法，特别是涉及一种微球荧光强度标准物质的定值方法。

背景技术

流式细胞分析(Flow cytometry，FCM)是以高能量激光照射高速流动状态下被荧光色素染色的单细胞或微粒，测量其产生的散射光和发射荧光的强度，从而对细胞(或微粒)的物理、生理、生化、免疫、遗传、分子生物学性状及功能状态等进行定性或定量检测的一种现代细胞分析技术，可对单个细胞准确的定量分析和分类。

流式细胞分析在医学基础、临床及科学研究中有着广泛的应用前景。在流式细胞仪的绝对定量分析中，采用了定量荧光素分子微球法，在该方法中需要特制的包含有荧光素分子的微球标准物质，再将包被不同分子数的微球混合，形成含不同数量荧光素分子的混合微球；在流式细胞仪仪器设置相同的条件下测定此微球标准物质及待测细胞的荧光响应值，根据微球上的荧光素分子数和与之对应的对数荧光响应值计算回归方程，得到待测细胞的生理参数。可以看到，具有特定荧光响应值的微球标准物质是实现此项测量的关键技术标准。目前流式细胞仪被广泛应用于国内外的临床医学检验、生物科学研究等重要领域中，其主要计量性能包括仪器荧光分辨率、灵敏度、光路及液流准直行、光电倍增管稳定性等。上述计量性能的好坏直接影响仪器测量结果的准确与否，在一些临床实验室需要对上述性能参数进行必要的质量控制和评价。目前国内没有相关的计量标准和检定规程，无法保证仪器量值的准确性和可靠性。

发明内容

本发明的目的是提供一种微球荧光强度标准物质的定值方法。

一种微球荧光强度标准物质的定值方法，包括如下步骤：

(1)制备微球荧光强度标准物质；

(2)测定荧光素粉末纯度，以备计算配制荧光素标准母液；

(3)校准荧光分光光度计，配制荧光素标准母液，建立仪器荧光响应值与荧光素浓度的校准曲线；

(4)测定微球荧光强度标准物质的颗粒数量浓度：用PBS溶液将微球荧光强度标准物质稀释得到悬浊液，用移液器吸取所述悬浊液置于网格滤膜上，并进行抽滤，将所述悬浊液中的颗粒物全部截留于所述网格滤膜上，然后对所述网格滤膜上的颗粒物进行计数，利用公式Ⅰ计算得到标准物质的颗粒数量浓度C_N：

CN=NV×f]]>     公式Ⅰ

C_N：微球荧光强度标准物质的颗粒数量浓度，ml^-1；

N：颗粒数量计数值；

V：移液器吸取悬浊液的体积，ml；

f：稀释倍数；

(5)测量样品荧光响应值，根据荧光响应值与荧光素浓度的校准曲线得到样品中的荧光素浓度，再根据标准物质的颗粒数量浓度C_N计算得到每个微球荧光强度标准物质颗粒所携带的荧光分子数MESF。

本发明所述微球荧光强度标准物质的定值方法，其中，所述步骤(1)具体步骤如下：

将异丙醇和蒸馏水按照重量比为0.2～2.0的比例配制成异丙醇水溶液，然后向100g所述异丙醇水溶液中加入5g～15g醋酸乙烯酯单体，0.5g～2.0g聚苯乙烯基吡咯烷酮和0.1g～0.3g过硫酸钾，在40℃～80℃条件下反应10h后，在80℃下烘干得到微球；称取1g～10g的所述微球，将其悬浮于300g质量分数为5％～20％的NaOH甲醇溶液中，在20℃～80℃条件下水解5h，然后用蒸馏水洗涤，再在80℃下烘干得到标称值为7μm的表面携带羟基的微球；量取0.1g～5g的所述表面携带羟基的微球加入到50ml～1000ml的异硫氰酸荧光素FITC缓冲液中，在20℃～50℃下培养3h后用浓度为20mmol/L的PBS溶液离心洗涤，得到荧光微球，所述离心转速为5000r/min～15000r/min；最后将所述荧光微球分散于100ml～500ml浓度为20mmol/L的PBS缓冲液中，得到微球荧光强度标准物质，并用显微镜检验微球荧光强度标准物质上羟基携带情况。

本发明所述微球荧光强度标准物质的定值方法，其中，所述步骤(2)具体步骤如下：