[发明专利]一种利用诱导子提高反应器培养东北刺人参不定根中有效物质的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，为一种利用诱导子提高反应器培养东北刺人参不定根中有效物质的方法。

背景技术

东北刺人参(Oplopanax elatus Nakai)又名刺参，五加科刺参属，多年生落叶灌木，是我国长白山特有的植物资源之一。东北刺人参药用价值极高，其根、根茎和茎是名贵的中药材，富含皂苷、多糖、黄酮、挥发油、蒽醌、脂肪酸等多种药用成分，可用于治疗神经衰弱、低血压、阳萎、精神分裂、糖尿病等疾病，并具有抗真菌、抗抑郁、解热、镇痛和抗衰老的作用。近年来又发现叶中含有的一些成分与根和茎相近，所以叶也具有药用价值。由于其疗效显著，且无任何毒副作用，在长白山区被称作“木本人参”。目前，对东北刺人参化学成分及药理作用的研究较多，但临床应用研究则较少，因此开发及研制东北刺人参高效药物，对东北刺人参资源的利用具有重要意义。由于其药用价值很高，人们过度采挖导致其野生资源短缺，人工栽培方面，有性繁殖，结实率低，移栽成活率低；无性繁殖出现假死现象，且恢复期生长期长，繁殖材料来源短缺，在栽培过程中易受气候和化学农药的影响，产量不能保持稳定，具有较大风险，因此寻找一种可以替代野生及人工栽培东北刺人参的方法已迫在眉睫，而利用植物组织培养进行中药资源繁殖并大规模生产已成为一条有效可行的发展途径，植物组织培养包括细胞培养，组织和器官培养，但药用植物细胞培养的弊端之一是有效成分含量不稳定，这主要是由于大多数有效成分均为次生代谢产物，其合成在细胞阶段表现不强而造成，而根培养可以解决这一问题。

不定根培养的优势在于其具有原始植物根所具有的巨大生物合成能力，根培养中细胞的高度分化使得次生代谢产物的合成能力明显提高，同时表现出明显的代谢稳定性和活力稳定性，加之与生物反应器的结合利用，使得东北刺人参不定根的大量生产得到了有效的保证，进而为东北刺人参野生资源的保护及开发提供了一条有效可行的方法。由于生产黄酮及多糖含量高且稳定的东北刺人参不定根在药物开发中极为重要，近年来，利用诱导子进行目标产物调控及生物合成已得到越来越多的国内外学者的关注，也是大幅度提高培养物中代谢产物的重要方法之一。

诱导子包括生物诱导子和非生物诱导子两大类，它具有专一性、快速性、浓度效应、时间效应以及协同效应，同一植物对不同诱导子的反应不同，因而刺激合成的代谢产物及其含量也有所不同，因此，在实际应用中应综合考虑与灵活运用，使诱导子在药用植物培养过程中发挥最佳促进作用。本发明选用三种非生物诱导子(茉莉酸甲酯、水杨酸、普鲁兰多糖)处理反应器培养的东北刺人参不定根，发现三种诱导子对东北刺人参不定根中黄酮含量均有大幅度提高，茉莉酸甲酯和普鲁兰多糖诱导子对不定根中多糖含量的积累也有明显促进作用，这对东北刺人参资源的开发利用有十分重要意义。

本发明利用气球型气升式生物反应器培养东北刺人参不定根，当不定根生物量达到最大时(培养30～40d)加入三种诱导子，处理10d，发现这三种诱导子处理后对不定根生物量影响不大，且促进不定根中黄酮的合成，使其含量得到显著提高；同时，利用茉莉酸甲酯和普鲁兰多糖作为诱导子可以提高东北刺人参不定根中多糖含量及生产量。该方法通过对反应器内不定根培养可在短时间内获得较高含量的东北刺人参黄酮及多糖，获得的高效代谢产物东北刺人参不定根对珍稀东北刺人参的资源利用与开发保护意义重大。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用诱导子提高反应器培养东北刺人参不定根中有效物质的方法。以反应器培养的东北刺人参不定根为材料，用茉莉酸甲酯、水杨酸及普鲁兰多糖对不定根进行处理，通过对三种诱导子浓度的筛选，制定提高东北刺人参中黄酮及多糖含量的具体方案，为珍稀东北刺人参资源的保护和开发利用提供一种新方法。

本发明采用了以下技术方案：

一种利用诱导子提高反应器培养东北刺人参不定根中有效物质的方法。

①东北刺人参不定根诱导和反应器培养

将东北刺人参无菌苗侧根诱导的不定根进行增殖，增殖获得的不定根称取20g(FW)接种于含有4L液体培养基的5L气球型气升式生物反应器中，通气量为300mL/min，温度为25℃条件下暗培养。

②诱导子处理

当反应器培养30～40d不定根生物量达到最大时(120～150g/L鲜物重)，收获反应器内不定根并收集培养液，称取10g不定根接种于含有100mL上述培养基的的三角瓶中，同时添加三种不同浓度的诱导子进行处理，10d后收获不定根，然后测定其生物量。

③东北刺人参不定根中黄酮含量及生产量的测定