[发明专利]一种栝楼抗肿瘤活性蛋白及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及植物蛋白的制备和应用，具体属于一种栝楼抗肿瘤活性蛋白及其制备方法，以及该蛋白在制备抗肿瘤药物中的应用。

背景技术

栝楼(Trichosanthes kirilowii Maxim)为葫芦科植物栝楼属多年生藤本植物。别名瓜篓、药瓜、吊瓜。栝楼适应性强，易成活，较耐寒，在我国主要分布于山东，河南，山西等省区。主要以果实和根部入药，在我国是历史悠久的常用中药材。

栝楼的药用部位主要包括瓜蒌、瓜蒌子和天花粉。瓜蒌为栝楼的干燥果实，属于常用中药材，始载于《神农本草经》，性甘、微苦，寒，归肺、胃、大肠经；瓜蒌具有清肺润燥、涤痰宽胸、利气开郁、涤痰散结、甘润解渴、润燥滑肠、清热消肿散结等功效。瓜蒌子又名瓜蒌仁，为栝楼的干燥成熟种子。瓜蒌子单用药最早见于《本草经集注》，性甘、寒，归肺、胃、大肠经。具有润肺化痰，滑肠通便之功效。天花粉为栝楼的块根，始载于《神农本草经》，性甘、微苦、微寒。归肺、胃经。具有清热生津，消肿派脓之功效。栝楼具有多种药理作用，且资源丰富，价格低廉。栝楼的深度开发和有效利用将会带来很高的经济和社会价值。

对现有技术的文献检索发现，目前国内外关于栝楼抗肿瘤活性蛋白的研究报道较少。报道的主要是以天花粉蛋白为代表的核糖体失活蛋白，但由于天花粉蛋白在临床上应用易引起过敏，发热等不良反应，因此其在临床上的应用逐渐减少。

发明内容

本发明的目的在于提供一种栝楼抗肿瘤活性蛋白及其制备方法，以及该蛋白在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明提供的一种栝楼抗肿瘤活性蛋白，通过包括如下步骤的方法制得：

第一步：取全栝楼，研磨粉碎后，加入蛋白提取液，4℃下浸泡并搅拌过夜，离心20分钟后取上清液，即为栝楼蛋白粗提液；离心后的滤渣可重复提取1-2次；所述的蛋白提取液为磷酸缓冲液(1升的磷酸缓冲液体系里含8g NaCl，0.2g KCl，3.63g Na₂HPO4.12H₂O,0.24gKH₂PO₄,pH7.4)；所述全栝楼和蛋白提取液的质量比为1:4-7，优选为1:5；

第二步：在栝楼蛋白提取液中加入1.5-2倍体积的-20℃预冷的丙酮，沉淀蛋白0.5-1小时，4℃离心，收集沉淀，在-20℃下放置约30-40min，使丙酮完全挥发，冷冻干燥，得到栝楼粗蛋白；

第三步：将栝楼粗蛋白用pH7.4的磷酸缓冲液冰上溶解，离心后取上清液，按硫酸铵溶液饱和度计算表(0℃)先加入30％饱和度的硫酸铵粉末，充分搅拌溶解后，静置30min，离心，收集上清液，再向上清液中加入60％饱和度的硫酸铵粉末，充分搅拌溶解后，静置，离心，收集沉淀，用PH7.4的磷酸缓冲液溶解、透析、浓缩即得到栝楼抗肿瘤粗蛋白；

第四步：将栝楼抗肿瘤粗蛋白用pH7.4的磷酸缓冲液溶解，过Q阴离子交换层析柱，收集穿透峰。

第五步：将上述穿透液过Sephacryl S-100凝胶凝胶层析柱，用pH7.4的磷酸缓冲液洗脱，收集得到栝楼抗肿瘤活性蛋白。

第一步、第三步、第四步、第五步均在0-4℃条件下进行。

采用SDS-PAGE凝胶电泳技术，通过与标准分子量对比，栝楼抗肿瘤活性蛋白的分子量约为60kDa。

经体外抗肿瘤活性检测显示，该栝楼蛋白可明显的抑制大肠癌DLD1细胞、乳腺癌MCF-7细胞、膀胱癌T24细胞和宫颈癌HeLa细胞的存活，且对正常细胞没有明显影响。该蛋白可以在制备抗肿瘤药物中应用。

与现有技术相比，本发明获得的抗肿瘤活性的栝楼蛋白经体外抗肿瘤活性检测，该蛋白具有良好的抗肿瘤细胞的活性，而对正常细胞没有明显毒副作用。

附图说明

图1栝楼抗肿瘤活性蛋白SDS-PAGE电泳图(经Sephacryl S-100凝胶层析柱纯化后所得纯蛋白样品，上样量为5μg；图中：G，目的蛋白；M，标准分子量)

图2栝楼抗肿瘤活性蛋白对细胞存活的影响

图3栝楼抗肿瘤活性蛋白的质谱鉴定

具体实施方式

实施例1：栝楼抗肿瘤活性蛋白的制备