[发明专利]一种基于相均衡倍频调制原理的时间分辨荧光检测方法

说明书

技术领域

本发明属于借助于测定材料的化学或物理性质来测试或分析材料的技术领域，特别涉及一种可以消除样品中底物的荧光干扰、消除环境背景光、消除空间电磁波工频干扰等信号以提升检测样品荧光测量信号强度、提高荧光检测精准度的基于相均衡倍频调制原理的时间分辨荧光检测方法。

背景技术

目前，免疫层析（lateral flow immunoassay, LFIA）快速检测试纸条多以胶体金或者荧光色素作为标记物。近年来免疫荧光检测领域在技术上取得突破，发展了时间分辨荧光（Time-resolved fluorescence, TRF）免疫分析技术，此技术具有灵敏度高、特异性强、荧光寿命长、稳定性好和无放射性污染等特点，可以广泛应用于现场定量检测，是未来即时检测技术发展的重要方向。

时间分辨荧光（Time-resolved fluorescence, TRF）免疫分析技术的具体操作过程是：在试纸条上的检测线（T）和质控线（C）区域进行荧光色素染色处理；将试纸条放入检测样品，当检测样品中含有能和荧光色素结合的检测标的物时，即能对样品的测量标的物进行荧光色素染色；然后利用激发光照射样品，激发荧光色素发出荧光，由最终的荧光的强度值分析出测量标的物的种类、浓度等信息。本技术要求在短时间根据荧光信息对测量标的物进行正确的分析。

然而，激发光照射激发出荧光的过程中，除了测量标的物发射的荧光，也即是标记在样品上的荧光色素的荧光信息外，还包括两大类干扰荧光，干扰荧光包括环境背景荧光和杂质激发荧光。所谓环境背景荧光，包括有样品底液或试纸条本身的自发荧光、反射的波段较宽的荧光、检测系统的漏光及电磁干扰等；杂质激发荧光主要是由于样品中包含非测量标的物的物质，这类物质也可能会被激发光激发出荧光，只是这类荧光的激发和淬灭过程和测量标的物荧光过程不同。上述这些干扰荧光波段与荧光色素发出的荧光波段相重叠时，如果干扰荧光和荧光色素发出的荧光相比，强度极其微弱，则利用传统的时间分辨荧光检测方法可以测量出标的物的浓度信息，但是，当荧光色素所发出的荧光的强度不足够强时，则会严重影响测量分析的结果。

在传统的时间分辨荧光检测方法中，激发光照射样品激发荧光发射衰减的过程中，在荧光发射最大值时并不检测荧光，而是延迟200μs左右时间，等待杂质激发荧光淬灭，再开始检测荧光，从而达到消除上述第二类干扰荧光的影响，以得到染色荧光色素所发出的荧光强度，从而获取测量标的物相对准确的信息。在此方法中，虽然能消除干扰物质激发荧光的影响，但是由于干扰物质具有不确定性，控制检测荧光延时也具有不确定性，故不能肯定完全消除所有干扰物质激发荧光，且上述方法并不能消除第一类环境背景光干扰，如背景自发荧光、检测系统漏光和电磁干扰等。

发明内容

本发明解决的技术问题是，现有技术中，激发光照射激发出荧光的过程中，除了测量标的物发射的荧光，也即是标记在样品上的荧光色素的荧光信息外，还包括环境背景荧光和杂质激发荧光两大类干扰荧光，而导致的虽然在传统的时间分辨荧光检测方法中，可以在激发光照射样品激发荧光发射衰减的过程中，在荧光发射最大值的时间点延迟200μs左右时间，等待杂质激发荧光淬灭，再开始检测荧光，从而达到消除上述第二类干扰荧光的影响，以得到染色荧光色素所发出的荧光强度，从而获取测量标的物相对准确的信息，但是由于干扰物质具有不确定性，控制检测荧光延时也具有不确定性，故不能肯定完全消除所有干扰物质激发荧光，且并不能消除第一类环境背景光干扰，如背景自发荧光、检测系统漏光和电磁干扰等的问题，进而提供了一种优化的基于相均衡倍频调制原理的时间分辨荧光检测方法。

本发明所采用的技术方案是，一种采用基于相均衡倍频调制原理的时间分辨荧光检测方法，所述方法包括以下步骤：

步骤1.1：采用基频信号发生器生成频率为X的规则波信号作为基频信号，所述频率为X的规则波信号调制激发光源，光源发射激发光，激发光作用于待测标的物上，触发荧光；

步骤1.2 ：控制光电传感器件以N倍于X的频率对被触发的荧光进行采样，得到采样周期中每个时刻的荧光强度信号A_i；i>0；30≤N≤80；

步骤1.3：将采样周期中每个时刻的荧光强度信号A_i进行信号滤波和AD转换，得到每个时刻的荧光强度信号A_i对应的每个时刻的荧光强度数字信号D_i；i>0；