[发明专利]利用otef启动子进行球孢白僵菌遗传转化方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，涉及一种利用otef启动子进行球孢白僵菌遗传转化方法。

背景技术

球孢白僵菌(Beauveria bassiana)是一种致病性与适应性很强，且寄主范围广的昆虫病原真菌，已被作为昆虫真菌制剂广泛用于玉米螟(Ostrinia furnacalis)的生物防治。在球孢白僵菌功能基因研究及基因工程育种过程中，启动子是外源或内源基因导入效率的重要因素之一。

目前，球孢白僵菌的遗传转化启动子主要采用来源于构巢曲霉的PgpdA启动子，长度为2000余bp，虽然具有良好的转化效率，但单一的启动子对不同类型基因进行转化时，会受到酶切位点而影响遗传转化载体的构建，其大小也会影响遗传转化载体的构建，并且影响转化效率，因此，开发一种新的高效启动子能够为球孢白僵菌遗传转化载体的构建提供更多的选择，为球孢白僵菌的功能性基因研究及基因工程育种奠定基础。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中存在的缺陷，提供一种利用otef启动子进行球孢白僵菌遗传转化方法。其具体技术方案为：

一种利用otef启动子进行球孢白僵菌遗传转化方法，包括以下步骤：

1)otef:GFP质粒载体的构建

利用特异引物以质粒otef:CAR为模板扩增得otef全序列，克隆到pUCm-T载体上，形成pUC-otef，并测序验证；然后用XbaI和NcoI双酶切pUC-otef和PF质粒，回收otef片段，克隆到用相同酶切的PF载体上，形成otef：GFP载体；

2)球孢白僵菌DNA提取

100mg菌粉液氮研磨成粉末；

置于预先加入600μL提取液的1.5mlEP管静置2min；

加入100μL10％SDS，充分混合后加入300μL氯化苄，剧烈振荡混匀；50℃水浴1h，不用颠倒；

加入100μL3MNaAc，4℃放置十分钟后使用，，冰浴15min后12000r/min离心10min；

吸取上清液转入新的离心管，加入体积比为25:24:1的水饱和酚/氯仿/Tris饱和酚抽提，12000r/min离心10min；

取上清加入RNA酶，65℃水浴30min；

加入体积比为25:24:1的水饱和酚/氯仿/Tris饱和酚抽提，12000r/min离心10min；

取上清，加入2倍体积的冰预冷无水乙醇，-20℃冰柜，即加满EP管，温和翻转，室温下沉淀30min，12000r/min离心10min；

弃上清，留沉淀，以50-100μL的70％乙醇洗沉淀物，12000r/min离心3min，洗涤1-2次；

干燥后，加入50μLTE溶解DNA，保存于-20℃备用；

3)球孢白僵菌原生质体的制备

将培养好的白僵菌菌液用漏斗过滤到空瓶中，留下滤布中得到的菌丝体；

渗透压缓冲液洗涤2-3遍，并用小勺收集菌丝到6mLEP管中；

在EP管中加入4mL的LB液体培养基，8μLβ-巯基乙醇，摇菌丝，使菌丝充分混入缓冲液中；

28℃下100r/min培养20-25min；

将EP管第二次过滤，收集菌丝体，并用渗透压缓冲液洗涤两次；

用小勺刮下滤布上的菌丝到新的EP管，加入4mL渗透压缓冲液，再加入0.1g的酶粉振荡；

28℃下100r/min培养1h，并镜检观察，此时视野中应得到透明圆球状的原生质体；

4)PEG介导的遗传转化

将得到的原生质体悬液吸取400μL到2个新的EP管中，做好标记，分别为CK对照MIG：GFP；

对应管中分别加入10μLMIG：GFP质粒，冰浴20min；

每个管中各加入100μLPEG4000溶液，混匀，冰浴20min；

各加入2mLPEG4000，混匀，常温放置5min；

加入4mL的0.7mol/L山梨醇溶液稀释；

吸200μL于软琼脂平板上，封口标记，于28℃恒温箱培养24h；

将1mL的渗透压缓冲液打在软琼脂平板上，重复吸打；吸出100μL均匀涂在带有PPT抗性的查氏培养基上，于28℃恒温箱培养并观察；

5)PCR检测

首先利用氯化苄法提取白僵菌基因组DNA,以MIG2-5特异性引物进行PCR及电泳检测；

6)转化子荧光观察

将转化子在PDA平板上划线26℃培养3天，挂下菌丝及孢子置于倒置荧光显微镜下观察。