[发明专利]一种利用玉米黑粉菌热击蛋白启动子进行球孢白僵菌遗传转化方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种利用玉米黑粉菌热击蛋白启动子进行球孢白僵菌遗传转化方法。

背景技术

球孢白僵菌(Beauveriabassiana)是一种致病性与适应性很强，且寄主范围广的昆虫病原真菌，已被作为昆虫真菌制剂广泛用于玉米螟(Ostrinia furnacalis)的生物防治。在球孢白僵菌功能基因研究及基因工程育种过程中，启动子是外源或内源基因导入效率的重要因素之一。

目前，球孢白僵菌的遗传转化启动子主要采用来源于构巢曲霉的PgpdA启动子，长度为2000余bp，虽然具有良好的转化效率，但单一的启动子对不同类型基因进行转化时，会受到酶切位点而影响遗传转化载体的构建，其大小也会影响遗传转化载体的构建，并且影响转化效率。因此，开发一种新的高效启动子能够为球孢白僵菌遗传转化载体的构建提供更多的选择，为球孢白僵菌的功能性基因研究及基因工程育种奠定基础。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用玉米黑粉菌热击蛋白启动子进行球孢白僵菌遗传转化方法，旨在解决上述背景技术中的不足。

本发明是这样实现的，

一种利用玉米黑粉菌热击蛋白启动子进行球孢白僵菌遗传转化方法，包括以下步骤：

(1)将来源于玉米黑粉菌热击蛋白启动子hsp70构建到以抗草胺磷基因bar为筛选标记、绿色荧光蛋白GFP为标记基因、TtrpC为终止子的遗传转化载体上，得到hsp70-F质粒；

(2)利用PEG法将步骤(1)中构建的hsp70-F质粒转入球孢白僵菌原生质体后均匀涂在带有PPT抗性的查氏培养基上，恒温培养。

优选地，在步骤(1)中，所述hsp70质粒的构建包括以下步骤：利用特异引物以质粒PF为模板扩增得PgpdA的全序列，克隆到pUCm-T载体上，形成pUC-PgpdA；然后用Xba I和NcoI双酶切pUC-PgpdA质粒，回收PgpdA片段，克隆到用相同酶切的PHD3-hsp70载体上，形成hsp70质粒；其中，所述特异引物序列为：

gpdAFPXba I：5'-GCTCTAGACAATTCCCTTGTATCTCTACACACA-3'，

gpdARPNcoI：5'-CATGCCATGGAGTACTTAGGGGAAATAAAGGTTCT-3'。

相比于现有技术的缺点和不足，本发明具有以下有益效果：本发明应用来源于玉米黑粉菌热激蛋白启动子hsp70介导球孢白僵菌遗传转化，其转化效率较常用的PgpdA启动子高出近60％，该转化过程并没有影响转化子的生物学特性及杀虫毒力。

附图说明

图1是本发明hsp70-F质粒的构建流程示意图；

图2是本发明实施例中球孢白僵菌原生质体的镜检观察图；

图3是本发明实施例中球孢白僵菌转化后在平板培养基上生长状况比较图；其中，图3a为转入hsp70-F质粒的球孢白僵菌培养基，图3b为对照组；

图4是本发明实施例中用hsp70特异性引物对孢白僵菌转化子基因组DNA进行PCR检测后的电泳结果图；

图5是本发明实施例中hsp70-F质粒转化子荧光显微检测结果图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1遗传转化载体的构建

如图1所示，将来源于玉米黑粉菌热击蛋白启动子hsp70构建到以抗草胺磷基因bar为筛选标记、绿色荧光蛋白GFP为标记基因、TtrpC为终止子的遗传转化载体上。具体过程如下：

利用特异引物以质粒PF为模板扩增得PgpdA的全序列，克隆到pUCm-T载体上，形成pUC-PgpdA，并测序验证。然后用Xba I和NcoI双酶切pUC-PgpdA质粒，回收PgpdA片段(约2200bp)，克隆到用相同酶切的PHD3-hsp70载体上，形成hsp70-F载体。

其中，特异引物序列为：

gpdAFPXba I：5'-GCTCTAGACAATTCCCTTGTATCTCTACACACA-3'，

gpdARPNcoI：5'-CATGCCATGGAGTACTTAGGGGAAATAAAGGTTCT-3'。