[发明专利]基于FTA卡保存DNA进行植物PCR检测的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种基于FTA卡保存DNA进行植物PCR检测的方法。

背景技术

自1983年世界上首例转基因作物——转基因烟草问世以来,转基因作物已获得了长足发展。到目前为止，全世界已有25个国家开始转基因农作物的种植，世界各国已试种的转基因植物超过4500种，已批准商业化种植的转基因品系已超过100余种。

棉花是我国重要的经济的作物，常年种植面积8000万亩以上。上世纪90年代，棉铃虫的大面积暴发严重影响棉花的产量和品质。1997年转Bt基因(Cry1Ac)抗虫棉开始在我国商业化推广种植。截至目前，转基因棉花除了Bt基因(Cry1Ac)外，还有抗除草剂基因CP4-epsps(5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合酶)和PAT/Bar，抗虫基因CpTI(豇豆胰蛋白酶抑制剂)和Cry1Aa(Bt基因的一个新的亚型)等品系；此外，为提高棉花纤维产量和品质，现在实验室阶段进行转化的基因有ACO1(1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶)，ACO2以及控制IAA合成的基因iaaM(FBP7-iaaM)等。

目前对转基因棉花的检测方法一般是通过采集新鲜的棉花叶片样品，液氮速冻带回实验室，然后用CTAB法或植物基因组提取试剂盒提取获得DNA，作为PCR试验的模板。然而，该方法提取DNA步骤繁琐，耗时，在DNA提取过程中易形成交叉污染，从而影响到检测准确性。此外，使用大量化学试剂，对环境造成污染。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于FTA卡保存DNA进行植物PCR检测的方法。

为了实现本发明目的，本发明的基于FTA卡保存DNA进行植物PCR检测的方法，所述方法包括用FTA卡采集植物叶片汁液，使植物基因组DNA吸附于FTA卡上，然后直接以吸附有植物基因组DNA的FTA卡作为PCR扩增的模板，进行PCR反应，从而实现对植物的检测。

具体地，所述方法包括以下步骤：

(1)取待检测植物叶片置于FTA卡标示的圆环范围内，用力挤压叶片使汁液均匀涂在卡片上，植物基因组DNA被吸附于FTA卡上；

(2)用打孔器或剪刀在上述吸附有植物基因组DNA的FTA卡上打孔或剪切取样，放入EP管中作为PCR扩增的模板；

(3)配制PCR反应体系，加入到上述已加入模板样品的EP管中，放入PCR扩增仪内，设置程序，进行PCR反应；

(4)分析PCR扩增产物。

前述的方法，步骤(2)中使用的打孔器直径为2mm，EP管体积为0.2mL。

前述的方法，步骤(3)中进行PCR反应使用的反应体系按25μL计为：2×MightyAmp Buffer for Card*112.5μl，10μmolL^-1正、反向引物各1μl，MightyAmp DNA聚合酶1μl，涂有DNA样品的FTA卡，用ddH₂O补齐至总体积25μl。

本发明中涉及的植物为转基因植物，例如转基因棉花等。

本方法的改进之处在于代替了室内提取DNA的繁琐步骤，节省了工作时间。用FTA卡涂抹叶片，无需液氮冷冻，室温存放，带回实验室可直接用于后续PCR检测，省去了单株提取DNA的工作，保存方法简单，降低了工作量，提高了工作效率。本方法特别适合于对申报安全评价证书的含有非法基因的转基因棉花材料进行快速检测；另外，新基因的转化体转基因的后代产生多个单株，需要快速鉴定阳性植株，采用FTA卡涂抹叶片直接用于PCR反应模板的方法，减少了工作量，缩短了工作时间，可提早获得目的转化株系。

本方法具有操作简单，可大规模单株取样，材料易于存放等特点，尤其能满足大量单株提取DNA模板进行PCR试验的需求。

附图说明

图1为本发明实施例1中Bt基因(Cry1Ac)特异性序列的PCR扩增结果；其中，M：Marker(DL2000)；1-3泳道：阳性棉花对照；4-6泳道：阴性(不含Bt基因的棉花DNA)；7-9泳道：空白对照；10-12泳道：试剂盒提取的DNA为模板；13-15泳道：FTA卡吸附的DNA为模板。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular cloning:a laboratory manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。