[发明专利]BCR‑ABL融合蛋白突变体及其编码基因、表达载体及其构建方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及BCR-ABL融合蛋白突变体及其编码基因、表达载体及其构建方法，还涉及该BCR-ABL融合蛋白突变体及其编码基因、表达载体在治疗慢性粒细胞白血病中的应用。 

背景技术

BCR-ABL融合蛋白具有异常激活的酪氨酸激酶活性，是慢性粒细胞白血病(Chronic myelogenous leukemia，CML)的典型标志，大于90％的CML病人表达BCR-ABL融合基因，而正常细胞中不表达BCR-ABL融合蛋白，且ABL位于胞核，RIN1主要定位胞浆。位于ABL段的SH3结构与BCR-ABL蛋白激酶活性激活有着直接的关系，可负向调控BCR-ABL的活性，其关键位点的突变或结合配体的改变均可引起伊马替尼(Imatinib，IM)耐药。酪氨酸激酶抑制剂IM，在CML的治疗中有可喜的成效，是治疗CML的里程碑，但是由于BCR-ABL激酶区T315I突变等原因，造成临床15％-20％病人对IM耐药，给CML的治疗带来一定困难，因此，解决IM耐药的问题已经成为CML研究的热点之一。 

研究发现，RIN1蛋白——Ras抑制因子1，是ABL的一个直接的激活因子并且控制对IM敏感的调定点。该蛋白通过自身富含脯氨酸的序列(PPAVPPPPVP)与ABL的SH3(PxxP motif)高特异性低亲和力的结合，降低细胞对IM的敏感性，且RIN1与BCR-ABL的结合不受T315I突变的影响，亦不受除SH3、SH2和TKD以外的Abl结构域的影响。不同的慢性粒细胞白血病细胞株中RIN1蛋白的表达不同，这种表达的不同影响细胞株对IM的敏感性。例如，耐药慢粒细胞株KCL22高表达RIN1蛋白，而对IM敏感的细胞株中RIN1表达较低，而K562细胞表达较低对IM敏感。 

目前，关于RIN1在CML方面的研究，主要包括：1.RNA干扰或者基因敲除后，和/或联合IM，分析ABL激酶活性、ABL磷酸化底物水平的变化以及相关的信号通路的研究；2.利用RIN1ABD结构域靶向结合ABL的功能，在RIN1蛋白上连接有功能的酶、核定位信号 等功能片段，或者基因突变该结构，从而达到抑制ABL酪氨酸激酶活性的目的。以上方法，不能直接阻抑RIN1和BCR-ABL的结合，且RIN1在不同的细胞中表现不同的生理功能，如在乳腺细胞中RIN1是抑癌基因，因此敲掉后可能会诱发乳腺癌的发生。 

发明内容

本发明的目的是提供一种BCR-ABL融合蛋白突变体及其编码基因、表达载体及其构建方法。 

本发明的另一目的是提供该BCR-ABL融合蛋白突变体及其编码基因、表达载体在治疗慢性粒细胞白血病中的应用。 

为了实现本发明目的，本发明提供的一种BCR-ABL融合蛋白突变体编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示： 

AACCTTTTCGTTGCACTGTATGATTTTGTGGCCAGTGGAGATAACTATCTAAGCATAACTAAAGGTGAAAAGCTCCGGGTCTTAGGCTATAATCACAATGGGGAATGGTGTGAAGCCCAAACCAAAAATGGCCAAGGCTGGGTCCCAAGCAACTACATCACGCCA 

本发明还提供了含有所述核苷酸序列SEQ ID NO:1的表达载体。 

所述表达载体为将所述的核苷酸序列SEQ ID NO:1插入穿梭质粒pAd-Track-CMV后与骨架质粒pAd-Easy-1重组得到。 

本发明还提供了构建所述含有核苷酸序列SEQ ID NO:1的表达载体的方法，包括如下步骤： 

(1)采用重叠延伸PCR方法进行扩增得到核苷酸序列SEQ ID NO:1的片段，包括三个反应体系：PCR1，PCR2和PCR3；PCR1以野生型ABL SH3为模板，上下游引物为F/Rm3；PCR2以野生型ABL SH3为模板，上下游引物为R/Fm3；PCR3以PCR1和PCR2的反应产物作为模板，上下游引物为F/R；所述引物序列为： 

F:5'-GCGTCGACAACCTTTTCGTTGCACTGTATGATT-3', 

R:5'-CCGCTCGAGTCATGGCGTGATGTAGTTGCTTGG-3', 

Rm3:5'-ATTCCCCATTGTGAATATAGCCTAAGACCC-3, 

Fm3:5'-GTGGAGATAACtatCTAAGCATAACTAA-3'；