[发明专利]苯乙醇胺A半抗原、抗原及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于食品安全检测技术领域，具体涉及苯乙醇胺A半抗原、抗原、单克隆抗体制备方法及其应用。

背景技术

β-受体激动剂在现代养殖业中被用于作为饲料添加剂，如之前为人们所熟知的克伦特罗等，这一类药物可以减少脂肪，增加瘦肉，提高猪的单位经济价值，但是它们都有危险的副作用，轻则导致心律不整，严重一点就会导致心脏病。

苯乙醇胺A，又称“克伦巴胺”，化学式：2-[4-（4-硝基苯基）丁基-2-基氨基]-1-甲氧基苯乙醇，分子式：C19H24N2O4，分子量：344，是新一代的瘦肉精。四川省广安市广安区枣山镇畜牧兽医站对某养猪场例行违禁药物监测中，用莱克多巴胺测试卡分别检测母猪、仔猪和育肥猪尿液，发现该场育肥猪尿检呈阳性，之后确认是新型添加物苯乙醇胺A。这种瘦肉精新品种惊现市场，再次敲响中国食品安全警钟。因此被农业部发布的第1519号公告列为“禁止在和动物饮水中使用的物质”。公告称，根据《饲料和饲料添加剂管理条例》有关规定，禁止在饲料和动物饮水中使用苯乙醇胺A等物质。各级畜牧饲料管理部门要加强日常监管和监督检测，严肃查处在饲料生产、经营、使用和动物饮水中违禁添加苯乙醇胺A等物质的违法行为。

目前，检测苯乙醇胺A的方法主要为仪器方法——高效液相色谱质谱法，这类方法需要专业的仪器设备和专业的人员进行操作，前处理繁杂，费时，不适合大量样本的筛查和基层人员操作。免疫化学分析由于在抗原抗体的定性定量方面独特的优势和操作简便快速、成本低、灵敏度较高、分析样本量大的优点弥补了理化分析的不足。苯乙醇胺A人工抗原的制备为这一方法的实施奠定了重要基础。影响免疫化学分析质量的根本因素是抗体的特异性与亲和性，这些性质又决定于免疫半抗原分子的结构，因此免疫半抗原的分子设计与合成就是产生特异性抗体和建立小分子兽药残留快速检测技术的最基础和最关键的步骤。

发明内容

本发明的目的是提供一种苯乙醇胺A半抗原、抗原、特异性抗体制备方法及其应用。

本发明提供的苯乙醇胺A半抗原，其结构为式Ⅰ所示：

式Ⅰ

本发明还保护式Ⅰ所示化合物的制备方法，包括如下步骤：

苯乙醇胺A138mg溶于10ml1mol/LHCl和4ml二甲基亚砜中；加入

锌粉100mg，80℃水浴搅拌反应30min，冷却过滤，滤液调pH8.0，20ml乙酸乙酯萃取2次，合并有机相，真空干燥；将残留物10mlDMF溶解，加入碳酸钾60mg,碘乙酸82mg，90℃加热反应3h，降低至室温，加入50ml蒸馏水，1M盐酸调pH6.0,50ml乙酸乙酯萃取2次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，真空干燥滤液，残留物即为半抗原。

本发明所提供的苯乙醇胺A抗原，是将苯乙醇胺A半抗原与载体蛋白偶联获得的抗原。

所述苯乙醇胺A抗原，其结构为式Ⅱ所示：

本发明还保护所述苯乙醇胺A抗原的制备方法，包括如下步骤：

称取半抗原10mg溶于2mlDMF，加入EDC4.3mg，NHS5.1mg，室温搅拌反应2h；50mgBSA溶于5ml0.1M碳酸氢钠缓冲液，将上述活化药物逐滴

加入到蛋白溶液中，室温搅拌过夜，PBS4度透析72小时，期间换透析液6

次。将透析液在无菌条件下过0.22μm孔径的滤膜，分装于安培瓶中，-20℃保存。

同法合成包被原。

常用载体蛋白均可采用，如牛血清白蛋白(BSA)，卵清蛋白(OVA)，人血清白蛋白（HSA），鼠血清白蛋白（MSA），甲状腺蛋白（TG）或血蓝蛋白（KLH）等。

所述苯乙醇胺A抗原可以作为免疫原制备苯乙醇胺A特异性抗体，也可以作为包被原制备酶标板。

所述抗体具体可为单克隆抗体。

式Ⅰ所示产物、所述苯乙醇胺A抗原、所述抗体均可应用于检测苯乙醇胺A。

本发明还公布了应用苯乙醇胺A抗原和苯乙醇胺A单克隆抗体制备得到的酶联免疫试剂盒。

所述酶联免疫检测试剂盒，是由包被有苯乙醇胺A抗原的酶标板、酶标抗体工作液、苯乙醇胺A系列标准品、底物显色液、终止液、浓缩复溶液、浓缩洗涤液。